Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к антигену кортикальных тимоцитов человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано в иммунодиагностике злокачественных новообразований.

Цель изобретения - получение гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, выявляющие антиген на 1 властных клетках больных лейкозом.

Штамм получают следующим образом.

Проводят соматическую гибридизацию клеток мышиной миеломы P3x63Ag8.653 и клеток селезёнки мыши BALB/C, иммунизированной тимоцитами челове-- ка. Мышь 4-кратно иммунизируют внутривенно в дозе клеток с интервалом в 4 недели. Тимус получают от детей в возрасте от 1 г до 14 лет,

подвергшихся открытым операциям на сердце. Пятую иммунизацию проводят Т-лимфоцитами периферической крови в дозе 2107 клеток. На 7-й день после последней иммунизации мышь забивают и в стерильных условиях извлекают селезенку . Селезенку измельчают в го могенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через 2 слоя марли и трижды отмывают средой 199. Клетки селезенки и клетки миеломы РЗхбЗ Ag8.653 сливают в соотношении 10:1(9 клеток селезенки: 9 -10 клеток миеломы), смесь клеток отмывают один раз средой 199 и помещают в объеме 20 мл среды 199 во флакон объемом 100 мл. В этом флаконе клетки центрифугируют при

сл

-4

оэ ел

оэ

20

00 об/мин в течение 3 мин и инкубиуют при. 37°С в течение 20 мин. Среду сторожно насухо отсасывают и добавлят 3 мл 50%- полиэтиленгликоля с ол.мае. 1500D. Через 70с во флакон вно- J сят 20 мл среды 199. Клетки-3 раза отмывают центрифугированием, не встряивая, и инкубируют 2 ч при 37°С в 20 мл среды роста (среда RPM1 1640, ,„ содержащей 15% телячьей.эмбриональной сыворотки, 2 мМ/мл глютямина, 0,1мг/мл интамицина. Затем клетки разливают по 0,2 мл в лунки плоскодонного 96-луноч- о-го плато. На следующей день среду . роста заменяют на селективную среду (среда роста, содержащая 0,1 мМ ги- поксантина, 5,8 мкМ азасерина). Видиые колонки появляются на 14-й день в 84 из 86 лунок. Проводы скрининг гибридом на тимоцитах человека. Скрининг проводят в непрямой реакции поерхности ойиммунофлуоресценции (РИФ). При обнаружении специфического свечения проверяют реакцию антител с моно- с нуклеарными клетками и гранулоцитами периферической крови здоровых лиц. После тестирования выявлено, что 6 гибридных клонов реагируют только с тимоцитами. Одну из 6 гибридом клонируют методом ограниченных разведений на фидере из клеток селезенки и тиму- са мышей BALB/C.

Для приготовления физера кусочки тимуса и селезенки разрушают в стеклянном гомогенизаторе Иоттера. Взвесь 35 клеток фильтруют через 2 слоя марли. Су спея з изо клеток разливают по 0,1 мл в лунки 96-луночного плоскодонного плато. Через 1-7 дней плато с клетками используют как фидер, При клониро- 40 вании клетки из продуцирующей лунки снимают нежным пипетироваиием. Клетки разводят в среде роста до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл среды и разливают по 0,1 мл в лунки на фи- 45 дер.

После первого клонирования колонки появляются в 22 -из 48 лунок на 16-й день. Проведено тестирование гибридом на тимоцитах человека. Антитела из 50 22 лунок реагируют с тимоцитами (позитивных клонов 100%). Проводят вто- рое клонирование. Колонии возникают на -14-й день в 19 из 60 лунок. Проведен скрининг на тимоцитах человека. Пози- $ тивных клонов после второго клонирования 100%.

Полученный штамм обозначен ИКО-44. Штамм гибридных культивируемых кле30

0

J „ с

5 0 45

50 $

0

ток депонирован под номером ВСКК(П) I 313Д.

Культуральные свойства. Стандартные условия выращивания.

Для выращивания штамма можно использовать стеклянную или пластмассовую посуду. Во флакон объемом 45 см засевают по 5-105 клеток штамма в 10 мл среды. Пассаж 1 раз в 3-4 дня той же дозой, без подсчета клеток 1:3 - 1:4. Штамм выращивают при 37°С в атмосфере 5% С0г на средеRPM1 1640 или среде MEM в 1Х модификации Дульбекко, содержащей 15% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ/мл глю- тамина, 0,1 мг/мл гептамицина.

Титр антител в культуральчой жидкости определяют непрямой реакцией поверхностной иммунофлюоресценции на живых тимоцитах. Интенсивность флюоресценции оценивают на флюоресцентном микроскопе при увеличении объектива 40, окуляра 2,5-10.Титр антител в культуральной жидкости 1:50.

Культивирование in vivo. Для выращивания асцитной опухоли из штамма гибридных клеток пригодны мыши самки линии BALB/C. Интактным мышам за 1-7 дней до прививки опухоли вводят внут- рибрюшинно (в/бр) по 0,5 мл 3%-ного пептона на вазелиновом масле. Клетки гибридомы инъекцируют в/бр по 10 клеток на мышь в 5 мл среды. Через 7-10 дней у мышей возникают асцитные опухоли. Культуру клеток гибридом поддерживают серийными пассажами асцитной опухоли. Титр антител в асцитной жидкости 1:10000.

Продуктивность. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 25 пассажей на витро и 15 пассажей ин виво. Титр антител в культуральной жидкости на протяжении 25 пассажей составляет 1:50 - 1:10, в асцитной жидкости титр антител на протяжении 15 пассажей 1:10000 - 1:1000.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на штатные среды. Заражение микоплазмой не выявлено.

Криоконсервирование . Клг.тки штамма ресуспендируют в среде RPM1 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки. К суспензии клеток добавляют 20% диметилсульфоксид до конечной концентрации 10%. Количество клеток па 1 ампулу объемом 1 мл составляет 10-20 106 . Замораживание проводят при в течение 2 ч, затем ампу

лы с клетками помещают в жидкий азот. Размораживание проводят при +40°С в течение 70 с. Жизнеспособность клеток после размораживания по включению трипанового.синего составляет 75-80%.

Характеристика целевого продукта. Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирует моноклоналъные антитела IgM класса. Класс иммуноглобулина определяют по методу Оухтерлони в реакции преципитации. С этой целью используют моноспецифические сыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши. Культуральную жидкость гибридомы концентрируют в 10 раз с помощью насыщенного сульфата аммония, диализируют и помещают в центральную лунку 1% агара. В периферические лунки вносят антиглобулиновые сыворотки. Через сутки образуется четкая полоса преципитации с сывороткой против IgM класса.

Специфичность монАТ ИКО-44 опреде- ляют в непрямой РИФ на различных типах клеток, прикрепленных к стеклу с помощью полилизина. В качестве монАТ используют культуральную или асцити- ческую жидкость штамма гибридных клеток ИКО-44.

Непрямой метод является двух- этапным. На первом этапе исследуемые клетки обрабатывают в течение 30 мин при 20 С монАТ. Клетки отмывают от air тител средой 199.На втором этапе клетки обрабатывают Г/ав/2 - фрагментами, полученными из коммерческой кроличьей люминесцирующей сыворотки против глобулинов белой мыши, в течение 30 мин при 0°С. Процент антиген - положительных клеток учитывают на флюоресцентном микроскопе под масляной иммерсией при увелечении объектива 90x100, окуляра х2,5-10.

МонАТ ИКО-44 реагируют в РИФ с 43,9Ј11,1% тимоцитов человека и не реагируют с клетками крови здоровых доноров.

П р и м е р 1. В костном мозге больного с острым лимфобластным лейкозом содержится 100% властных клеток. Костный мозг больного получают при стернальной ггункции. Фенотип бла- стных клеток определяют в РИФ. Количество антиген - положительных клеток учитывают на флюоресцентном микроскопе при увеличении объектива 40, окулярах хЮ.

10

15

20

25 765616

На 36% властных клеток определяется антигенв выявляемый монАТ ИКО-44. Другие маркеры властных клеток %: 1а - подобный антиген 80; Thy 1 - антиген 3; общий антиген ОЛЛ 4,5; антиген Т10 25; LFA - 1 антиген 21; Jx-ranT6H 14; CR 3 рецептор 29. Диагноз Т-клеточного ОЛЛ устанавливают по наличию антигена Т10, определяемого монАГ 20. Экспрессия антигена, выявляемого монАТ ИКО-44, на 36% бласт- ных клеток указывает на то, что властные клетки находятся на стадии диф- ференцировки кортикальных тимоцитов, подвариант Т-2 ОЛЛ.

Приме р2.В костном мозге боль- кого с лимфосаркомой-содержится 100% бластных клеток. На- 85% властных клеток экспрессировал антиген, определяемый монАТ ИКО-44. Фенотип бластных клеток %: 1а - подобный антиген 10; Thy - 1 антиген 2; LFA - 1 антиген 7,5; х-гаптен 28; общий Т-клеточный антиген 65; антиген хелперных индукторных клеток 19; поверхностные иммуноглобулины 3,5. Диагноз Т-клеточ- ной лимфосаркомы установлен по наличию общего Т-клеточного антигена, выявляемого монАТ ЛГ 7. Экспрессия антигена, распознаваемого монАТ ИКО- 44, на 85% бластных клеток указывает на то, что бластные клетки находятся на стадии дифференцировки кортикальных тимоцитов. Диагноз - Т-2 подвариант -лкмфосаркомы.

Таким образом, моноклональные антитела, полученные с помощью гибридомы, идентифицируют антиген кортикальных тимоцитов человека. МонАТ ИКО-44 могут быть применены в иммунодиагностике лимфопролиферативных заболеваний. Экспрессия антигена кортикальных тимоцитов на бластных клетках позволяет выявить у больных с лимфопролиферативными заболеваниями - бластные клетки, находящиеся на стадии дифференцировки кортикальных тимоцитов. Выявление иммунологического Т-2 подварианта лейкоза и лимфосаркомы необходимо для создания более эффективных программ лечения больных. Формула изобретения

30

35

40

45

50

55

р м у л а

Мтамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) № 31ЗД - продуцент монокло- ,нальных антител к антигену кортикальных тимоцнтов человека.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в иммунодиагностики злокачественных новообразований. Цель изобретения - получение гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, выявляющие антиген на бластных клетках больных лейкозом. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N313Д. Штамм получен соматической гибридизацией клеток мышиной миеломы Р3 .63AG 8.653 и клеток селезенки мыши BALB/C, иммунизированной тимоцитами человека. Мон АТ, продуцируемые гибридомой, относятся к JGM класса. Титр антител в культуральной жидкости 1:50 на протяжении 25 пассажей, в асцитной жидкости 1:10000 на протяжении 15 пассажей. Мон АТ реагируют в РИФ с 43,9±11,1% тимоцитов человека и не реагируют с клетками крови здоровых доноров.