Способ получения восстановленного цитохрома С Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/00 

ОО О

00

00 4

00

Изобретение относится к 6Ho:KitMii:Kj а именно к энзимологии,, и касается усовершенствования метода восстановления цитохрома С - редокс-белка,, используемого для определйгшя активное- ти некоторых окислительно-восстанови - тельных ферментов, например цитохро- моксидазьт.

Цель изобретения ускорение про цесса и улучшение качества целевого продукта за счет увелшгения степени его восстаиовленностио

Способ заключается в том,, что ддк электрохимического восстановле1-1ия цитохрома в электрохтдат ческой ячейке с двумя индифферентнъп т электродами из блах ородного металла, через jmcT вор цитохрома С пропускают постоянный электрический ток плотностью 0.,Об- Oj 12 мА/мм и одновременно обрабатывают его ультразвуком мощностью 250 300 Вт и частотой 22±1,65 кГц- в тече ние 2-4 мин. Раздельное использование ультразвука или электрического тока неэ ективно. Предложенный способ - позволяет ускорить :п:роцесс в 5 раз j а также увеличить степень восстанэв-- ленности от до .

Пример К Взвешивают 61,5 мг цктохрома С фирмы (ФРГ) и растворя-- ют Е 50 мл дисти:г1лированной водз; (приготовляют водный раствор цитохро ма С концентрацией 10 М)„ Вносят готовый раствор в стеклянньй химичес- кий стаканчик с двумя гшатиновьми электродами, выполнентзгх: из платико вой проволоки длиной 100 м и диамет ром 1 мм каждый, подключенных к универсальному источнику питания а Вводят магнитострикционньй излучатель ульт -развукового диспетчера в раствор изт тохрома С

В течение 3 мин производят одно временное пропускание постоянного

электрического тока плотностью 0,09.мА/мм и озвучивание раствора ультразвуком мога,ностью 30 Вт с чаето - той 22+1,65 кГц„ Переносят 3 т раствора цитохрома С из стаканчика в спектрофотометрическую кювету с дли- ной оптического пути 0,3 см и запн- сьшают спектр поглощения цитохрома С на спектрофотометре в диапазоне 430 5ВО им В ту же кювотз с раствором цитохрома С добавляют несколько кристалликов гидросульфата натрия пере- меппгаают и вновь записьтают спектр поглощения цитохрома d

По диагра1-4мам записи спектров рас считывают степень восстановленности цитохрома С по отношению к максимальному восстановлению;, достигаемому с помощью гидросульфита натрия ; Рас чет прор.зводят nq форьгуле:

bf hj

степень восстановяенности,,% высота oi в .спектре поглощения цитохрома С, восстановленного предлагаемым элек грох1-мическим способом s

X OOs

где X

h

oi

к

высота. ОС -пика в спектре поглощения цитохрома С,, вое- станозленного гидросульфитом натрия, ммв

Степень восстановленности цитохрома С 87%,

П р и м е р 2в Способ осуществляют аналогично-примеру 1 при следующих параметрах; плотность тока 0,06 мА7мм ; мощность ультразвука 250 Вт| частота ультразвука 22± ±1,65 кГц; время 2 мин Степень вос- стаковл.€;нности цктохрома С 32%.

II р т-;: м е р Зв Способ осуществляют анап:огич:но примеру 1 при следующих параметрах: штотность тока 0,1 2 tviA/мм мощность ультразвука 350 Вт; час тота ультразвука 22.±1,65 кГц; время 4ьшн, Степень восстановленности цитохрома С 64%,

В таблице приведены данные зависимости степени восстановленности цктохрома С от плотностиj мощности и частоты ультразвука и. времени их воздействиде

При разработке данного способа прведено 130 экспериментов, в результате которых выявлены оптимальные и граничные значения параметров плот-

нести.тока, мощности и частоты ультразвука , э. также времени сочетанного воздействия постоянного электрического тока и ультразвука. Во всех опытах (5 опытов)5 проведенных при оптималь ных значеьшях использоБанкых физических факторов, степень зосстановленнос- ти цитохрома С в среднем

Воздействие ультразвука при избранных в качестве опти1-1альньт нараметрак мощности и частоты не вызьшает дена- турационных изменений в белковой час- ти цитохрома С, , не изменяет его физико - он-шчаских и каталитических свойств., Это доказывается спектрофо 13

тометрически (сохранение неизменного спектра поглощения цитохг ома С после ультразвуковой обработки) и энзимоло- гически {сохранение способности к автоокислешш и окислению цитохромо- Kci-одазой в той же степениj что и у цитоз рома С, восстановленного известными способами). Следовательно, использование ультразвука в .комбинации с постоянным электрическим тохом для йосстановления хщтохрома С правомер но. .

Таким образом, комбинированное воздействие постоянного электрическо- го тока и ультразвука в оптимальных параметрах позволяет в 5 раз ускорить процесс восстановления цитохрома С и в 1,5-2 раза увеличить степень его восстановленности, -

Применение предлагаемого способа позволяет заменить конструктивно сложную электрохимическую ячейку с разделенным катодным и анодным пространством на обычный химический стаканчик.

Предлагаемый способ позволяет проводить восстановление цитохрома С без применения промотора транспорта электронов.

Формула изобретения

Способ получения восстановленного цитохрома С, включающий приготовление раствора цитохрома С, внесение его в электрохимическую ячейку с двумя индифЛерентными электродами из благородного металла и последующее его восстановление путем пропускания постоянного электрического тока, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и улучшения качества целевого продукта за счет увеличения степени его восстановленности, при пропускании тока осуществляют одновременное воздействие на раствор ультразвуком мощностью 250- 350 Вт и частотой 22+1,65 кГц в течение 2-4 мин, а плотность тока устанавливают равной 0,06-0,12 .

Продолжение таблицы

Изобретение относится к биохимии, а именно к энзимологии. Целью изобретения является ускорение процесса и улучшение качества целевого продукта за счет увеличения степени его .восстановления. Способ включает приготовление раствора цитохрома С, внесение его в электрохимическую ячейку, пропускание постоянного электрического тока плотностью 0,06- , 0,12 мА/мм в течение 2-4 мин и одновременное воздействие на раствор ультразвуком мощностью 250-350 Вт и частотой 22+1,65 кГц. 1 табл. с

300 22+1,65 250 . 22+1,65 350 22+1,65

300 22+1,65 300 22+1,65

5

2

4

3

5

30

90

3

5

Примечание, Величина тяга, использованных параметров мощности и частоты УЗ, и плотности тока на электродах обусловлена техническими характеристиками приборов УЗДН-2Т и УИП-. Каждая группа опытов включает 5-10 экспериментов.

5А

32

6А

0

2

10

14

0

О

57 60 61 65 68 70 74 78 83