Способ получения ферментного электрода для определения L-лактата Советский патент 1993 года по МПК G01N27/327 

Изобретение относится к биохимии, а именно к методам получения ферментных электродов, и может быть использовано з энзимологии для научно-исследовательских целей и в медицине или микробиологической промышленности для электрохимического определения L-лактата в биологических средах, например в крови, в целях диагностики.

Цель изобретения - упрощение процесса.

Механизм действия ферментного электрода объясняется электроокисленй- ем восстановленного цитохрома 02 на поверхности модифицированного электрода. Цитохром Ь2 восстанавливается Ыпактатом: Цит .Ь2(ж. L-лактат- г Цит .йасвос.у+пируват. В ходе обработки сажи азотной кислотой на ее поверхности образуются электроактивные хиноновые группы (Q). катализирующие злектроокисяение цитохрома 02: -. Цит.Ь2(вос.) + Q Цит.Ь2(ок.) + QH2

QH2-- 2е - 2Н + Q

Изобретение осуществляют следующим образом.

Сажу ПМ-75 перед модификацией выдерживают в 55%-ной азотной кислоте в течение 5 сут при комнатной температуре. После этого ее промывают водой до нейтральной реакции (рН 7,0} и высушивают. Смесь приготовленной сажи и раствора фторопластового лака в ацетоне диспергируют ультразвуком при44 кГц в течение 0,5-1 ч. В полученную суспензию сажи погружают электрод на 3-5 с, затем его сушат, промывают дистиллированной водой и буферным раствором последовательно. На поверхность модифицированного сажей электрода

наносят 10 мкл цитохрома Ь2, накрывают капроновой сеткой, а затем диализной цело- фановой мембраной, которую закрепляют резиновым кольцом.

Электрод погружают в 0,1 М К-фосфат- цитратный буферный раствор рН 7,0, подключают к полярографу, задавая рабочий потенциал -0,2 В относительно Ag/AgCI. В измерительную ячейку вводят раствор исследуемого вещества и регистрируют зависи- мость стационарного тока электрода от концентрации L-лактата.

Пример 1. Определение концентрации L-лактата а водном растворе.

Электрод готовят по общей методике. При диспергировании сажи ультразвуком берут раствор ацетона, содержащий 2-5% фторопластового лака и 12:20% сажи; Определяют зависимость электрода от концентрации L-лактата при потенциале электрода -0,2 В относительно Ag/AgCI электрода сравнения (см.табл.1).

Из таблицы видно, что. линейная зависимость тока от концентрации наблюдается до 0,5 мМ L-лактата (см.чертеж).

Анализ показывает, что при использовании предложенного электрода электро- акисление лактата протекает при низком потенциале, что позволяет исключить электроокисление аскорбиновой кислоты. Так- же, как видно из чертежа электрод обладает высокой чувствительностью (5.8 мкА/мм L- лактата), что позволяет использовать для анализов биологические растворы, разбавленные в более высокой степени. При повы- шении концентрации сажи или лака выше верхнего предела ухудшается электрохимическая обратимость поверхностных групп сажи, и при выходе на нижний предел ухудшается стабильность электрода.

Аналогично примеру 1 устанавливают, что электроокисление аскорбиновой .кислоты протекает при потенциале -0.1 В относительно Ag/AgCI, поэтому ее присутствие не влияет на определение лактата при -0,2 В.

П р и м е р 2. Определение стабильности электрода.

Готовят электрод по общей методике. В течение 12 сут периодически определяют величину тока электрода (потенциал элект-

рода -0.2 В относительно Ag/AgCI, концентрация лактата 0,1-0,3 мМ). Данные приведены в табл.2.

Видно, что предлагаемый электрод сохраняет работоспособность не менее 12 сут, в ходе которых произведено не менее 40 измерений. Промывка электрода и измерение занимает не более 4 мин.

П р и м е р 3. Определение концентрации лактата в биологических растворах.

Готовят электрод по общей методике. Определяют концентрацию L-лактата в плазме крови и культуральной жидкости выращивания продуцентов вируса лейкоза быка аналогично примеру 1. Параллельно определяют концентрацию лактата спектро- фотометрическим способом, по восстановлению феррицианида, катализируемому флавоцитохромом Ь2 при введении исследуемого образца е спектрофотометриче- скую ячейку. При введении в спектрофо- тометрическую или электрохимическую ячейку образцы биологических жидкостей разбавляются в 10-40 раз. Полученные данные приведены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, концентрации L-лактата, определенные при помощи ферментного электрода и измеренные спек- трофотометрическим способом, практически совпадают. Время определения не превышает 4 мин. Следовательно, полученный электрод может быть применен для определения L-лактата в биологических средах.

Преимуществом способа является упрощение модификации стеклоуглеродного электрода.

Формула изобретения Способ получения ферментного электрода для определения L-лактата. включающий адсорбцию цитохрома b на слое токопроводящего материала, о т л и ч аю - щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса, модификацию электрода проводят сажей, предварительно окисленной в азотной кислоте, при этом сажу перед нанесением на электрод диспергируют в суспензии ацетона, содержащей 2-5% фторопластового лака и 12-20% сажи.

Использование: анализ биологических растворов в медицине для диагностики и в микробиологической промышленности. Цель - упрощение процесса, уменьшение рабочего потенциала и увеличение чувствительности. Сущность: при изготовлении ферментного электрода цитохром bz наносят на поверхность стеклоуглеродного электрода, модифицированного сажей ПМ-75, предварительно окисленной в азотной кислоте, которую перед нанесением на электрод диспергируют в суспензии ацетона, содержащей 2-5% фторопластового лака и 12-20% сажи. 1 ил.. 3 табл. ё

Таблица 1

5

Ч

Г

Z

f Таблица 2

Таблица 3