Способ получения глутаматдегидрогеназы Советский патент 1988 года по МПК C12N9/06 

00

;о сд

а:

о

Изобретение относится к биотехнологии, а конкретно к технологии получения ферментных препаратов.

Цель изобретения - упрощение и

ускорение процесса получения глута- матдегидрогеназы, а также более полного использования сырья.

Способ заключается в том, что в

;качестве исходного растительного сырья используются отруби пшеницы,

|из бесклеточного экстракта которых с помощью гель-хроматографии на се- фарозе 2В выделяют связанную с мембранами глутаматдегидрогенаэу. Глу- таматдегидрогеназа может быть использована в связанном с мембранами сос1ТОЯНИИ или подвергнута обработке фос фолилазой С для получения гомогенного и свободного от фосфолипидов пре- парата фермента. Получение гомогенного по белку препарата глутаматде- гидрогеназы за одну стадию хромато- графической очистки приводит к упрощению и ускорению процесса, а выделе ние из одной порции исходного сырья свободной и связанной с мембранами глутаматдегидрогеназы позволяет комплексно использовать это сырье.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример. 100 г отрубей пгае- ницы тщательно гомогенизируют в фарфоровой ступке в 0,05 М трис-НС1 буфере рН 7,4, в соотношении навески отрубей к объему буфера 1:5, после чего гомогенат центрифугируют при 10000 X g в течение 10 мин. Надосадо ную жидкость подвергают гель-хроматографии на колонке с сефаразой 2В Бесклеточный экстракт разделяется на два пика. Высокомолекулярный пик содержит только мембранно-связанную глутаматдегидрогеназу в виде округлых субклеточных структур размером около 1 мкм. Взвешивание упаренного и освобожденного от буферных солей препарата показывает, что из 100 г отрубей получается- 47 мг мембранносвязанной глутаматдегидрогеназы в

расчете на белок), а общая масса мембрано-связанного фермента равна 980 мг.

Эффективном способом освобождения глутаматдегидрогеназы от мембран яв- ляется обработка фосфолипазой С в концентрации не меньшей чем на 1 мл раствора мембранно-связанной глутаматдегидрогеназы. Освобоясденная от

0 5

0

5 0 5

0

мембран гомогенная глутаматдегидр оге- наза является термостабильным ферментом (температура инактивации 80 с), что делает ее перспективной биотехнологии. Молекулярная масса глута- матдегидрогенаяы, определенная при электрофорезе в присутствии додецил- сульфата натрия - 55 кДа.

П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, но используют 0,5 мкм форсфолипазы С на 1 мл мемб- рано-связанной фракции. Получают препарат глутаматдегидрогеназы, свободной от фосфолипидов.

П р и м е р 3. Вьщеление проводят по примеру 1, но используют фосфоли- пазы Д или А. В обоих случаях не происходит отделения глутаматдегидрогеназы от фосфолипидов.

П р и м е р 4. Вьщеление проводят по примеру 1, но используют сефадекс- Г-200. Мембранно-связанная глутамат- дегидрогеназа загрязняется другими высокомолекулярньгми продуктами.

Таким образомj использование

предложенного способа позволяет значительно упростить и ускорить процесс выделения за счет исключения: многостадийной хроматографической очистки препарата, а кроме того, комплексно использовать исходное сырье для выделения как свободной, так и связанной с мембранами глутаматдегидрогеназы. Формула изобретения

1.Способ получения глутаматдегидрогеназы, включающий гомогенизацию растительного сырья -в буферном растворе, отделение бесклеточного экстракта и выделение из экстракта целевого продукта хроматографичес- кими методами, отличающий- с я тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, в качестве растительного сырья используют отруби пшеницы, а выделение глутаматдегидрогеназы из экстракта проводят гель- хроматографией на сефарозе 2В.

2.Способ по п., отличающийся тем, что, с целью более полного использования сырья, проводят обработку полученной после гель- хроматографии связанной с мембранами глутаматдегидрсгеназы фосфолипазой С в количестве 0,5-1 мкг на 1 мл препарата с последующим получением свободной глутаматдегидрогеназы.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к техноло- гии получения ферментных препаратов. Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса получения глутаматде- гидрогеназы, а также более полное использование сырья. Способ заключается в гомогенизации исходного растительного сьфья, в качестве которого предлагается использовать отруби ницы, получении бесклеточного экстракта и вьщелении из него мембрйнно- связанной глутаматдегидрогеназы гель- хроматографией на сефарозе 2В. Полученный препарат глутаматдегидрогеназы может быть использован в связанном с мембранами состоянии или подвергнут последующему отделению с мембраны обработкой фосфолипазой в количестве 0,5-1 мкг на 1 мл ферментного препарата с получением свобод- ного фермента. Применение способа позволяет значительно упростить и ускорить процесс выделения двух типов препарата глутаматдегидрогеназы. 1 з.п. ф-лы. (Л