Способ получения натриевых солей производных мурамилпептидов Советский патент 1986 года по МПК C07K9/00 A61K38/14 

11 Изобретение относится к способу получения новых биологически активных соединений, а именно натриевых солей прои.зводных мурамилпептидов общей формулы , Ri-ф ONH-CH-CONH-CH-CHjCH7COA (L)(D) где R( - C-,-С -алкил, Rj - водород, СН,; R} - С,-С4-алкил-, А- -Y-O-P-O-CH -CH-CH -R ONa Rii где Y - -0-CHj,4:ONHCH CH,-, -NHCH CHj -, -NH-CH(CH) -CONHCH CH (L) R. - водород, (ртт„ч ртд и L. )l/t-CHo (CH2)i/i.-СНз Цель изобретения - получение новых производных мурамилпептидов, об ладающих более высокой иммуностимул рующей активностью в сочетании с ни кой токсичностью. Пример 1. Натриевая соль N -ацетил-мурамил-Ь-аланил-В-изоглюта минил-Ь-аланин-2-(1,2 -дипальмитоил-5п-глицеро-3 -фосфорил)-эт:иламиДа (1). К 1,0 ммоль 1-о6-бензш1-Ы-ацетил-4,6-изопропилиден-мураминовой кислоты и 0,9 ммоль Ь-аланил-В-изоглютаминил-1-,-аланин-2-( 1 ,2 -дипальмитоил-8п-глицеро-3 -фосфорил)-этилам да в смеси 15 мл диметилформамида-, 10 мл тетрагидрофурана и 2 мл пиридина добавляют 1,2 ммоль дициклогексилкарбодиимида и 1,3 ммольN -оксисукцинймида. Через 24 ч к реакционной смеси добавляют несколько капель воды, отфильтровывают осадок дициклогек силмочевины, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток очищают с по6мощью колоночной хроматографии на силикагеле (Мерк) с использованием в качестве элюента смеси хлороформ метанол (7:3). Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают, К остатку добавляют смесь 12 МП ледяной уксусной кислоты и 8 мл воды, выдерживают 1. ч при 50 С, а затем гидрируют в течение 20 ч при комнатной температуре и атмосферном давлении в присутствии 10%-ного палладия на угле. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме, остаток растворяют в-150 мл воды. Полученный раствор фильтруют через тефлоновЫй фильтрат типа Миллипор (5 мкм). Фильтрат подвергают диализу при перемешивании в ультрафильтрационной ячейке Амикон с использованием мембраны типа Амикон YM 10 с применением диафи-пьтрации против последовательно 400 мл воды, 200 мл смеси 0,1 М натрийфосфатный буфер 0,1 М раствор NaCJ (рН 7,0), 850 мл воды. Внутренний диализат фильтруют черезтефлоновый фильтр типа Миллипор (0,45 мкм). Фильтрат сушат лир.фильно. В итоге получают 1,08 г (91%) соединения ,M +13,9 (С i,0i уксусная кислота). Найдено, %: С 53,89; Н 8,63;N 6,40; Р 2,22i Na 1,58. , С5,Н,„ N,0 PNa 3 Н,0 .Вычислено, С 53,59; Н 8,75; N 6,40; Р 2,36; Na 1,75. Пример 2. Натриевая соль Н-ацетил-мурамил-Ь-аланил-В-изоглютаминил-Ъ-аланин-2-(1,2-дипальмитоил-Зп-глицеро-З -фосфорил)-этиламида (1). К раствору 1,0 ммоль В-изоглютаминил-Ь-аланин-2-(1 ,2-дипальмитоил-Зп-глицеро-З -фосфорил)-этиламида и 3,5 ммоль К-эти.пморфолина в 25 мл смеси хлороформ - метанол - вода (65:25:4) добавляют по каплям 1,5 ммоль N-oкcиcyкцини шднoгo эфира Н-ацетил-мурамил-Ъ-аланинав 5,О мл диметилацетамида. Реакционную смесь перемешивают 8 ч при комнатной температуре, добавляют 130 мл воды и упаривают в вакууме для удаления хлороформа и части метанола. Оставишйся водный раствор фильтруют через тефлоновый фильтр типа Миллипор(5 мкм). Фильтрат подвергают диализу при перемешивании в ультрафильтрационной ячейке Амикон с использованием мем3браны типа Амикон YM 10 с примене нием диафильтрации последовательно против 400 МП воды, 200 мп смеси 0,1 М натрийфосфатный буфер -0,1 М раствор NaCi (рН 7,0) и 850 мл воды Внутренний диализат фильтруют через тефлоновьй фильтр типа Миллипор (0,45 мкм). Фильтрат сушат лиофильн В итоге получают 1,20 г (91%) соеди нения 1, Rr 0,29 (хлороформ - метанол - вода 65:25:4) (А), 0,65 (хлор форм - метанол - уксусная кислота вода 25:15:4:2) (Б). По всем остальным физико-химичес ким характеристикам полученньй продукт полностью соответствует соединению, полученному в примере 1. Пример 3. Натриевая соль К-ацетил-мурамил-Ь-аланил-В-изоглютаминил-Ь-аланин-2-(1 ,2 -дипальмитоил-8п-глицеро-3 -фосфорил)-этиламида ( Т) . 0,26 г (0,75 ммоль) N-ацетил-мурамил-Ь-алаикна 1,2Н20 и 0,172 г (1,5 ммоль) N-оксисукцинимида растворяют в 3,0 мл абсолютного диметил ацетамида. К полученному раствору при О С добавляют 0,232 г (1,13 ммол дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 8 ч при и добавляют раствор 0,445 г (0,5 ммол В-изоглютаминил-Ь-аланин-2-(1 ,2 -дипальмитоил-Зп-глицеро-З-фосфорил )-этиламида и 0,07 мл (0,5 ммоль триэтиламина в. 12 мл смеси хлоро/форм - метанол - вода (65:25:4). За тем реакционную смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре, добавляют 60 МП этилацетата, перемешивают несколь1 о минут на ледяной бане и фильтруют. К фильтрату добавляют 65 МП воды и полученную смесь упаривают в вакууме для удаления легколетучих органических растворителей. Ос тавиийся водный раствор подвергают диализу при перемешивании в ультрафильтрационной ячейке типа Амикон с использованием мембраны типа Амикон YM 10 последовательно против 200 мл воды, 100 мл смеси 0,1 М натрийфосфатный буфер -0,1 М раствор NaC2(pH 7,0) и 425 мл воды. Внутренний диализат фильтруют чере тефлоно вьй фильтр типа Миллипор (0,45 мкм Фильтрат сушат лиофильно. В итоге по лучают 0,546 г (83%) соединения 1, RI 0,45 (ацетонитрил - вода 3:1). По всем остальным физико-химическим ха6рактеристикам полученньш продукт полностью соответствует соединению, полученному в примере 1. Пример 4. Натриевая соль N-aцeтил-дeзмeтилмypa ил-L-aлaнил-D-изоглютамин-2-( 1 ,2 -дипальма тоил-Sn-глицеро-З -фосфорил)-этиламида (fl), Из 1,0 ммоль В-изоглютамин-2-(1 ,2 -дипальмитоил-Зп-глицеро-З-фосфорил)-зтиламида -2,8 НО и 1,5 ммоль N-оксисукцинимидного эфира. N-aцeтил-дeзмeтилмypaмил-L-aлaнинa аналогично примеру 2 получают 1,18 г (96%)- соединения II, R, 0,29 (А), 0,65 (Б). Найдено, %: С 53,67, Н 8,16; N 5,93i Р 2,40; Na 1,71. С„Н ,o,N50,gPNa- 2,8НгО Вычислено, %: С 53,88; Н 8,25; N 5,71; Р 2,53; Na 1,88. Пример 5. Натриевая соль М-ацетил-мурамил-Ь-аланил-В-изоглютаминил-у-окси-метилкарбонил-2-(1 ,2-дипальмитоил-Зп-глицеро-З -фосфорил) -этиламида (ly). Из 1,0 ммоль В-изоглютаминил- -окси-метилкарбонил-2-(1 ,2 -дипальмитоил-Зп-глицеро-З -фосфорил)-этилам1 да и 1,5 ммоль N-оксисукцинимидного эфира К-ацетил-мурамил-Ь-аланина аналогично примеру 2 получают 1,20 г (92%) соединения ГЦ, R, 0,28 (А), 0,68 (Б). Найдено, %: С 53,21; Н 8,09; N 5,18; Р 2,21; Na 1,58; СзвНюб N O oPNa- 3,1 Вычислено, %: С 53,40; Н 8,13; N 5,37; Р 2,38; Na 1,78. Пример 6. Натриевая соль Ы-ацетил-дезметилмурамил-Ь-аланил-В-из оглютамин-2-(3-пальмитоил-рац-глицеро-1-фосфорил)-этиламида (ly), Из 1,0 ммоль В-изоглютамин-2-(з пальмитоил-рац-глицеро-1 -фосфорил)этиламида и 1,5 ммоль N-оксисуки нимидного эфира N-ацетил-дезметимурамил-Ь-аланина аналогично примеру 2 получают 0,69 г (69%) соединения iV, R 0,47 (А). Найдено, %.: С 47,22; Н 7,17; N 7,31; Р 3,01; Na 2,14, NjO PNa- 3,2 Вычислено, %: С 47,08; Н 7,24; 7,04; Р 3,12;- Na 2.31. П Ри М е Р 7. Натриевая соль -ацетил-мурамил-Ь-аланил-В-изоглютаминил-Ь-аланин-2-(3 -пальмитоил-рац-глицеро-1-фосфорил)-этиламида ф. Из 1,0 ммоль В-изоглютаминил-Ь-аланин-2-(3 -пальмитоил-рац-глицеpo-l -фосфорил)-этиламир,а и 1,51чмол N-оксисукцинимидиого эфира N-ацетил мурамил-Ь-аланина аналогично приме ру 2 получают соединение V, R О, 22 (А Найдено, %: С 47,71, Н 7,81; N 7,55; Р- 2,71-, Na 2,01 ;, C,H7gNgO,gPNa. 3,1 Вычислено, %: С 47,92-, Н 7,24; N 7,80; Р 2,88; Na 2,1Д. Пример 8. Натриневая соль Ы-ацетил-дезметилмурамил-Ь-аланил-В-изоглютаминил-Ъ-аланин-2-(l ,2 -дипальмитоил-Зп-глидеро-З -фосфорил)-этиламида (ут), Из 1,0 ммоль В-изоглютаминил-Ъ-апанин-2(1 ,2-дипальмитоил-Snглицеро-3 -фосфор1-ш)--этиламида и 1,5 ммоль N-оксисукцинимидного эфир N-aцeтил-дeзмeтилмypa ил-L-aлaнинa аналогично примеру 2 получают 1,065 (82%) соединения VI, R± 0,39 (А). Найдено, %: С 53,68, Н 8,02; N 6,38; Р 2,24, Na 1,60 .. PNa- ЗН,0 Вычислено, %: С 53,47; Н 8,14; N 6,45; Р 2,38; Na 1,77. Пример 9. Натриевая соль N-аце т ил-де з ме тилмурамил-L-аланил-В-изоглютаминил-Ь-аланин-2-(3 -па митоил-рац-глицеро-1 -фосфорил)-эт амида (vfi) Из 1,0 ммоль N-изoглкл aминил-LI-аланин-2-(3 -пальмитоил-рац-глице ро-1 -фосфорил)-этиламида и 1,5 ммол Н-нитрофенилового эфира N-адетил-дезме гилмурамил-Ь-аланина аналоги но примеру 2 получают соединение VI 4.J 0,16 (А). Выход 0,755 Г (71%). Найдено, %: С 47,48; Н 7,09, N 7,80i Р- 2,71; Na 2,01-, C z TeNbOiS PNa- 2, Вычислено, %: С 47,66; Н 7,19; N 7,94; Р 2,93; Na 2,17. Пример 10. Натриевая соль N-aцeтил-мypaмил-L-(xL-aминoбyтиpшI-В-изоглютаминил-Ь-ала 1Ин-2-( l , 2 -дипальмитоил-Зп-глицеро-З -фосфорил)-этил амида (VIJI). Из 1,0 ммоль В-изоглптаминнл-1-аланин-2-(1 ,2 -дипальмитоил-Sn-глицеро-З -фосфорил)-этиламида, 1,5 ммоль N-aцeтил-мypaмил-L-oi,-aми номасляной кислоты, 2,5 ммоль дйци логексилкарбодиимида и 3,0 ммоль N оксисукдинимида аналогично примеру получают соединение Vlll, RL 0,32 (А). Найдено, %: С 53,74; Н 8,23; 6,04; Р 2,18; Na-1,54, СбоНцо NbO,, PNa- 3,93Н20 Вычислено, %: С 53,56; Н 8,18, 6,25; Р 2,31-, Na 1,71. Пример 11. Натриевая соль пpoпиoнил-нopмypaмил-L-aлaнил-Bизоглютаминш1-Ь-ал;анин-2-( 1 ,2 -диальмитоил-Зп-глицеро-З -фосфорил)этиламида (IX). Из 1,0 ммоль В-изоглютаминил-Lаланин-2-(1 ,2 -дипaль итoил-Sn-гли- еро-З -фосфорил)-этиламида м 1,5 ммоль N-оксифталимидного эфира N-пропионил-нормурамил-Ъ-аланина аналогично примеру 2 получают 1,15 г (87%) соединения IX, R 0,16 (A),(CO,547 ykcycнaя кислота). Найдено, %: С 53,31; Н 8,26; N 6,14; Р 2,15; Na 1,55. C5gH(o8NgO,,PNa 3,5 Вычислено, %: С 53,53, Н 8,17; N 6,35; Р 2,34, Na 1,74. Пример 12. Натриевая соль N-aцeтил-мypaмил-L--aлaнил-S-изoглютамин-2-( 1, 2 -дипclль итoил-3n-глидеро-3 -фосфорил)-этиламида (X). Из 1,4 ммоль В-изоглюта1 шн-2-( 1,2-дипальмитоил-Зп-глицеро-3 -фосфорил) -этиламида и 2,0 ммоль N-оксисукдинимидного эфира К-а1летил-мурамил-L-аланина аналогично примеру 2 полугчают 1,52 г (88%) соединения Х, R; 0,31 (А), 0,64 (Б). Найдено, %: С 5,63, Н 8,25, N 5,87; Р 2,40; Na 1,59-, , ,3PNa. 2, Вычислено, %: С 54,49; Н 8,35; N 5,68; Р 2,51, Na 1,86. Иммуностимулирующая активность сое-динений 1- была изучена в опытах in vivo по способности увеличивать образование антител у мышей. Исследования проводились в сравнении с известным иммуностимулятором - N-бензоил-мурамил-Ь-аланил-В-изоглютамином, который является структурным аналогом соединений 1-Х. Мьшшй породы NMRI иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 10 мг БСА. Через 9, 15 и 29 дней отобрали пробы сыворотки крови и исследовали их на содержание антител к БСА с помощью метода пассивной гемагглютинации. В использованной дозе (10 мг/кг) БСА для животньк-реципиентов субиммуноКак видно из таблицы, соединения 1-Х обладают высокой иммуностимулирующей активностью в сочетании с низкой токсичностью и по активности зна чительно превосходят известный иммуностимулятор - Ы-бензоил-мурамил-Ь-апанил-В-изоглютамин (XI). Формула изобретения Способ получения натриевых солей производных мурамилпептидов общей формулы

Р5--0-С-(

о

I

отличающийся тем, что, соединение общей формулы CH20R6 ORa t, с(н COL и R имеют указанные значения и R каждый в отдельности во7дород ИЛИ совместно и 3 опр опил ид е и; Rg - водород, бензил; L - ОН или остаток формулы NH-CH(R,)-COOX, (L) имеет указанные значения; .водород,п -нитрофенил, пентахлорфенип.

9 , 127790610

конденсируют в инертном органическом-Ш-СН(К)-СО-,

растворителе или смеси растворите-Гт )

лей при температуре от 0°С до комнат- указанные значения

ной температуры с соединением общей ус ловии, что Е - -NH-CH(R J-COOX, формулы 5

CCWHi если L - ОН и Е - водород,

E-wH-CH-CHiCHiCO-T-o-p-o-cHr-at-cHri если L - -Ш-СН(ЕЗ)-СООХ,

П)ОН R4

где У, R и Rj имеют указанные зна-отщепляют в случае необходимости имечения;ющиеся защитные группы и полученное

Е - водород или остатоксоединение переводят в его натриевую

формулы . ,соль.

Ш

Изобретение относится к производным пептидов, в частности к нагCHzORe OR8+E-NHNHC{0)Ri RXH-C