Способ индентификации сероваров бактерий вида BacILLUS тнURINGIеNSIS Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/70 C12N7/00 

со со со

со

4;ib

Изобретение относится к микробиологической Т1ромьш ленности и касается энтомопатогенных микроорганизмов Вас. thuringiensis. Штаммы Вас. thuringi- ens is широко используются в микробиологической промьштенности в качестве продуцентов бактериальных средств с вредными насекомыми.

Цель изобретения заключается в разработке нового способа идентификации штаммов Вас. thuringiens Is I, 11, ill, IV, V,.XIV серотипов, характеризующегося меньшей трудоемкостью за счет снижения затрат времени и труда и позволяющего идентифицировать варианты t серотипа.

I Поставленная цель достигается тем, что штамм Вас. thurIngiensis идентифицируется путем одновременного опре- деления его чувствительности к набору фагов: Tgl3, Tgl8, Tg25, TpllS, g21, Tdl5. Установлено, что каждьй из изученных серотипов Вас. thurIng lensiS проявляет чувствительность только к своей определенной, отличной от дру- гих группе фагов, что позволяет с высокой точностью и достоверностью отно сить изучаемый штамм к определенному серотипу (см. таблицу) .

j-..-

I Из данных таблицы видно, что I се- ротип var. insectus чувствителен только к фагу Тд25, а к фагам Tgl3, Tgl8, Tdl5, g21, TpllS не чувствителен; f серотип, var. thurfngiensis чувствителен к фагам Tg25, Tdl5, TpI15 и не чувствителен к фагам , Tgl8, g21; II серотип, var. finitimus чувствителен к фагам Tdl5, g21 , Tpl 15 и не чувствителен к фагам Tgl35 Tgl8, Гд25; III серотип, var. kurstaki чув- твителен к фагам Tgl3, Tg2-5 , TgI8, fTpllS и не чувствителен к Tdl5, g2 ; IV серотип, var. deriHrolimus чувстви- Стелен к фагам Tdl5, Tpl 15 и не чувст- ителен к Tgl3, Tg25, Tgl8, g21; V Ьеротип, var. galleriae чувствителен IKO всем использованным фагам; XIV се- |ротип, var. israelensis чувствителен fc фагу g21 и не чувствителен к Tgl3, |Гд25, TglB, Tdl5, ТрП5. Таким образом каждый серотип чувст ителен только к определен ному фагу «ти к определенной группе фагов, т.е. меет свой спектр чувствительности к Предложенной группе фагов. Определив, К каким фагам из предложенной группы 1увствительна проверяемая культура.

д 5

0 5 0

.

,, с

5

по таблице можно определить ее серотип.

Получение и характеристика фагов, необходимых для определения серотипов штаммов Вас. thuringiensis .

Фаги Tgl3, Tg25, Tgl8, Tdl5 получены в лабораторных условиях путем вьщеления из почвы методом обогащения; фаги д21, Tpl15 выделены из про- мьшшенных фаголизатов при производстве энтобактерина. По классификаций Тихоненко перечисленные фаги относятся к следующим группам; фаги Tgl3, TdI5, Tg25 и Тр115 относятся к III группе фагов с сокращающимся чехлом отростка; фаг Tgl8 - к И группе, которая характеризуется удлиненным капсидом и структурой типа воротни- ка, расположенного между капсидом и коротким отростком; фаг д21 - к I группе; фаги, относящиеся к этой группе, Характеризуются головкой ик- сагональной формы и несокращающимся отростком, заканчивающимся кисточко- образными выростами.

При титровании на штаммах Вас. thuringiensis var. gaileriae негативные колонии этих фагов имеют следующую морфологию: фаг Tgl8 - колонии средних размеров (d 3-4 мм), центр прозрач.ный, вокруг полупрозрачная оборка ; фаг д21 - мелкие, прозрач- гые колонии; фаг Tgl3 - мелкие точечные прозрачные колонии; фаг TdI5 - колонии диаметром 1,5-4 мм, очень прозрачные с резко очерченными Краями; фаг Тд25 - колонии средних размеров (d. до 3 мм), центр прозрачный с двумя полупрозрачными оборками вокруг; фаг Tpl15 - очень мелкие (d до 1 мм), прозрачные колонии.

Все фаги, необходимые для данной работы, хранятся в бульоне Хоттинге- ра. Титр используемого фага не менее 10 фаговых частиц/мл. Препараты фагов получают методом сливного лизиса с последующим центрифугированием и фильтрованием. Весь набор препаратов фагов может быть получен в течение 3-5 дней. При хранении фагов в холодильнике () или при комнатной температуре титр фагов остается неизменным в течении 5-6 мес.

Фаги , Tgl8, Tg25, Tdl5, ТрП5, g21 депонированы во Всесоюзной коллекции пррмышленных микроорганизмов и имеют соответственно регистрационные номера: ВКПМ РН-660, ВКПМ РН-661,

3

ВКПМ РН-бб-, BKI1M РН-663, ВКПМ РН-665, ВКПМ РН-662.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определяют серо- тип культуры Bacillus thurtngiensis.

Культуру Вас. thuring Tens is, cepo- ТИП которой необходимо определить, выращивают в бульоне Хоттингера в чение 3-4 ч при 37 С при равномерном покачивании (220 об/мин). Для определения серотипа испытуемой культуры необходимо иметь 6 фагов: Tgl3, Tg25, Tgl8, Tdl5, TpllS, g2 с исходным титром 10 фаговых частиц/мл, размноженных на штамм Вас. thuringiens is JV серотипа.

Испытуемую культуру Вас. thurin- fgiensis в объеме 0,3 мл добавляют до 3 мл солевой среды следующего состава, г: Cacij-6H,jO 0,11; МдСЦ

139

те-

0,14; 0,15; MgSO,, 1,2; агар Difсо 6, бульон Хоттингера 200 мл, дистиллированная вода 800 мл, 25 рН 7,2-7,4, и выливают на чашку Петри со слоем 2% агара Хоттингера. Затем чашку Петри с испытуемым газоном культуры делят на 6 зон, в каждую из которых петлей наносят по одной капле каждого из вьшеупомянутых шести фагов. Затем чашку Петри ставят в термостат на 28°С. Через 19 ч по общей картине наличия или отсутствия лизиса культуры во всех шести зонах судят о фагочувствительности испытуемой культуры. Контролем служит штамм V серотипа, на котором все шесть фагов дают отчетливую зону лизиса.

Лизис испытуемой культуры наблюдается только в зоне фага Тд25. Сравнивая результаты опыта с таблицей, дела1рт вьюод, что испытуемая культура относится к I серотипу, var. in- ,sectus.

Пример 2. Определяют серо- тип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуеВсе операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наб; сдается в зоне фагов 20 Tdl5 и Тр115. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод,что испытуемая культура относится к IV серотипу. Пример 6. Определяют серотип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне всех 6 фагов. Сравнивая результаты с таблицей, делают вывод, что испытуемая 30 культура относится к V серотипу.

Пример 7. Определяют серотип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуе- мой культуры наблюдается в зоне фага д21. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к XIV серотипу,

Предлагаемый способ идентификации 40 штаммов I, II, III, IV, V, XIV серо- типов Вас. thuringiensis с помощью набора фагов менее трудоемок по сравнению с известным способом, основанном на применении типовых специфичес- 45 ких иммунных сывороток. Для осуществления предлагаемого способа требуется 3-5 дней - столько времени занимает размножение данного набора фагов.

Это примерно в 10 раз меньше времени, мой культуры наблюдается в зоне фагов сп необходимого для получения иммунных Тд25, TdI5 и ТрП5.сьшороток, процесс получения которых

длится 2-3 мес и требует многократной иммунизации животных. Предлагаемый способ не требует наличия животных.

Пример 3. Определяют серотип обеспечивает стандартность и досто- культуры Вас. thuringiensis.верность получаемых результатов и позволяет .дифференцировать варианты IJ

thuringiensis и insectus внутри I серотипа, что невозможно при использоСравнивая результаты опыта с таблицей, делают вьшод, что испытуемая культура относится к I серотипу.

Все операции осуществляют в соответствии с примером .1 . Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне фа

- ,

25

99341

гов Tdl5, g21, . Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вьшод, что испытуемая культура относится к серотипу II.

Пример 4. Определяют серотип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуе- - 10- мой культуры наблюдается в зоне фагов, Tgl3, Tg25, Tgl8, TpllS. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к III серотипу.

15 Пример 5. Определяют серотип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наб; сдается в зоне фагов 20 Tdl5 и Тр115. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод,что испытуемая культура относится к IV серотипу. Пример 6. Определяют серотип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуемой культуры наблюдается в зоне всех 6 фагов. Сравнивая результаты с таблицей, делают вывод, что испытуемая 30 культура относится к V серотипу.

Пример 7. Определяют серотип культуры Вас. thuringiensis.

Все операции осуществляют в соответствии с примером 1. Лизис испытуе- мой культуры наблюдается в зоне фага д21. Сравнивая результаты опыта с таблицей, делают вывод, что испытуемая культура относится к XIV серотипу,

Предлагаемый способ идентификации 40 штаммов I, II, III, IV, V, XIV серо- типов Вас. thuringiensis с помощью набора фагов менее трудоемок по сравнению с известным способом, основанном на применении типовых специфичес- 45 ких иммунных сывороток. Для осуществления предлагаемого способа требуется 3-5 дней - столько времени занимает размножение данного набора фагов.

51

вании способа на основе иммунных сывороток.

Формула изобретения

Способ идентификации сероваров бактерий вида BacHlus thurf nglens is отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, на исследуе мую культуру воздействуют бактерио-, фагами ВКПМ № РН-660, ВКШ № РН-661, ВКПМ № РН-662, ВКПМ S РН-663, ВКПМ № РН-664, ВКПМ № РН-665, при этом к серовару Insectus относят культуры, чувствительные к фагу ВКПМ № РН-664,

к серовару dendrolimus - к фагам ВКПМ РН-663, ВКПМ РН-665, к серовару thuringiensiS - к фагам ВКПМ

5 № РН-663, ВКПМ № РН-664, ВКПМ,№. РН-665, к серовару Israel ens Is - к фа гу ВКПМ № РН-662, к серовару fin timus - к фагам ВКПМ ff РН-662, ВКПМ № РН-663, ВКПМ № РН-665, к серовару kurs10 taki - к фагам ВКПМ № РН-660, № РН-661, ВКПМ,№ РН-664, ВКПМ № РН-665, к серовару gallerlae - к фагам ВКПМ № РН-660, ВКПМ РН-661, ВКПМ № РН-662, ВКПМ № РН-663, ВКПМ

5 № FH-664, ВКПМ РН-665.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается идентификации энтомопатогенных микроорганизмов вида Bacillus thurin- giens is. Целью изобретения является упрощение способа. Штамм Вас. thurtn- g I ens is идентифицируется путем одновременного определения его чувствительности к набору фагов ВКПМ ffPH-660, ВКПМ № РН-661, ВКПМ № РН-662, ВКПМ № ГН-663, ВКПМ №РН-664, ВКПМ № РН-663. Каждый из полученных серо- варов проявляет чувствительность только к своей определенной, отличной от других группе фагов. Это позволяет с высокой точностью и достоверностью относить изучаемый штамм к определенному серовару. 1 табл.

Определение серотипов штаммов thurIngiensls по спектру чувствительности к набору фагов Tgl3, Tgi8, Tg25, Tdl5, Tpl15,д21

СеротипыTgl3 Tg25 | Tgl8 T(J15 g21 I ТрП5

,1 серотип (var. Insectus) - 4 - - Примечание Наличие зоны лизиса на газоне испытуемой

культуры.

- Отсутствие .зоны лизиса на газоне испытуемой культуры.