Способ получения 3 @ -цианоморфолинопроизводного доксорубицина Советский патент 1988 года по МПК C07H15/24 A61K31/706 

см

Изобретение касается способа получения нового 3 -цианоморфолинопроиз- водного доксорубицина формулы

О ОН

CO-CHgO

он

НхСО

(I)

обладающего противоопзгхолевой активностью.

Цель изобретения - получение нового производного доксорубицина, обладающего большей активностью, чем из- вестный структурный аналог - доксору- бицин и его аналоги.

П .р и м е р 1. Получение и отделение 3.-деамино-3 -(3 -циано-4 -мор- фолинил)доксорубицина и З -деамино- 3-(3 -циано-4 -морфолинил)-13-ди- гидродоксорубйцина.

К перемешиваемому раствору, состоящему из 6,25 г (60,0 ммоль) 1,4- ангидро-эритритола, характеризуемого

формулой

ОН он

Q

в 75 мл воды, охлажденной в водяной бане до 15-20°С, добавляют 6,42 г (30 ммоль) метапериодата натрия. Полученный в результате чистый раствор перемешивают при комнатной темпера- туре в течение 17 ч, величину рН раствора доводят от 3 до 7,3 с помощью NaHCO и затем полученный раствор разбавляют при перемешивании 75 мл , при этом происходит образова- ние осадка. Полученную смесь подвергают перемешиванию и добавляют 0,126 г (2 ммоль) в 15 мл смеси, состоящей из СНзСН и воды в соотношении, равном 1:1 (объемным). К этой смеси далее добавляют 1,16 г (2,0 ммоль) гидрохлорида доксорубицина в 30 МП смеси, состоящей из CH,CN и воды в соотношении 1:1, Спу0

5

5

0

-

стя 10 мин полученную реакционную смесь разбавляют 50 мл разбавленного раствора NaHCO, и экстрагируют далее три раза с помощью СНС1, порциями по 50 мл. Этот полупродукт - экстракт, содержащий 3 -деамино-3 -(4 -морфо- линил)доксорубицин,3 -деамино-3-(4 - морфолинил)- 3-дигидродоксорубицин, 3 -деамино-3 -(3 -циано-4 -морфолинил) доксорубицин и 3 -деамино-З -( циано-4 -морфолинил)-13-дигидродоксо- рубицин. Соединенные экстракты подвергают экстрагированию с помощью 0,1 н. уксусной кислоты 5 раз по 25 МП, а затем с помощью воды и далее промывают разбавленным раствором и насыщенным водным раствором хлорида натрия. Кислотную водную фазу затем отделяют. Хлороформную фазу подвергают сушке с помощью сульфата натрия, фильтруют через целит-диатомовую землю и подвергают концентрированию с получением в результате остатка. Этот остаток подвергают растворению в 25 мл СНС и. растворитель подвергают повторному вьшариванию под вакуумом при комнатной температуре. В результате получают 0,518 г (40% от теоретического выхода) стеклообразного вспененного материала темно-красного цвета.

Образец этого вспененного стеклообразного материала в количестве 0,424 г подвергают растворению в 1,5 мл и вводят в колонку размером .1 ,5 -3,5 см, промытую и заполненную селикагелем типаВ10-511А имеющим размер частиц, соответствующий ситу № 200-400 (т.е. 0,074 - 0,037 мм). Колонку подвергают элюи- рованию с помощью 50 мл , а затем смесью, состоящей из CHCl и CHjOH, причем первая порция, объемом 150 мл представляет собой смесь в ciD- отношении 99:1. Вторая порция объемом 150 мл представляет собой смесь в соотношении 98:2, третья порция объ емом 300 мл представляет собой смесь в соотношении 97:3, четвертай порция объемом 100 мл представляет собой смесь в соотношении 95:5 и пятая порция объемом 300 мл представляет собой смесь в соотношении 90:10. После сбора начального элюата в количестве 445 мл фракцию объемом 80 мл подвергают вьшариванию с получением в результате 0,217 г продукта. Этот материал подвергают смешению с 0,039 г рчищенного продукта, полученного ранее, и полученную смесь подвергают растворению в 2 мл , разбавляю 10 мл СН,ОН и вьшаривают досуха. В результате растирания этого остатка с 5 мл CH,OH получают 0,218 г з -де- амино-3 -{3 -циано-4 -морфолинил) доксорубицина.

Анализ данных, полученных с помощью жидкостного хроматографирования с высокой разрешающей способностью и методом ядерно-магнитного резонанса при частоте 400 МГц, показал, что этот продукт представляет собой ди- астереоизомерную смесь.

Анализ методом жидкостного хроматографирования с высокой разрешающей 20 способностью на колонке типа С-18 фирмы Waters Radial - Rak с использованием 0,05 М буферного раствора цитрата, характеризуемого рН 4 и , в соотношении 65:35 при скорое- 25 N 4,20. ти подачи, равной 2 мл/мин, показал наличие двух близкорасположенных пиков, на 14,4 мин и 15,7 мин, в соотношении 58:39. Анализ спектра ЯМР этого материала при частоте, равной .. 400 МГц, показал существование двух резонансов для 1-Н, 2-Н, 3-Н, 1 -Н, 7-Н, 14-Н, 9-ОН, OCH-j, 10А-Н и

6 -Hj-npOTOHOB.

Данные анализа спектра 5ШР при частоте 400 МГц, (CDClj)S : 14,02 (син- глет, 6-ОН), 13,26 (синглет, 11-ОН), 8,05, 8,04 (2 дублета, 1-Н), 7,80, 7,79 (2 триплета, 2-Н), 7,41, 7,40

Дальнейшее элюирование содержимого указанной колонки привело к получению 0,041 г 3 -деамино-3 -(3 -ци 15 ано-4 -морфолинил)- 3-дигидродоксо- рубицина.

Данные ультрафиолетового спектра Vis () максимум 234 нм ( 252 (28,000), 289 (9,390), 475 (12,700), 496 (12,800), 530 (7,410).

Масс-спектр (как производные три- метилсилила) м/е 985 М (триметилси- лил)5-СН,, 973 М (триметилсилил)5-НС

Вычислено,%: С 57,57; Н 5,89;

1,5 Найдено,%: С 57,35; Н 5,94; N3,82

Предлагаемое соединение обладает 30 полезностью в качестве противоопухолевого агента для млекопитающих. Дан ная активность подтверждается данны ми исследований ин виво и ин витро. В одном из опытов ин виво, проводите MOM в соответствии с протоколом, опи санным в работе Gamer Chemotherapy Reports National Gamer Institute, 3, № 2, Ч.З, от сентября 1972 г., здоро вые мыши инокулировались интраперито

(2 дублета, 3-Н), 5,61. 5,57 (2 дуб- 40 нально асцитной жидкостью лимфоцит лета, I -H), 5,34, 5,30 (2 мульти- плета, 7-Н), 4,79, 4,78 (2 синглета. 14-Hj, 4,54, 4,42 (2 синглета, 9-ОН), 4,11, 4,10 (2 синглета, OGH,), 4,05

лейкемия Р-388. Инокулированные мыши затем обрабатывались на 5,9 и 13 сут истекшего периода времени различными количествами предлагаемого соедине(мультиплет, 5 -Н), 3,97 (мультиплет, 45 я. Для сравнения другие мыши были 2 -В-Н, 3 -Н, 6 В-Н), 3,71. (муль- необработанными, а еще дополнитель- типлет, 4 -Н, б -А-Н), 3,58 (триплет, 2 А-Н), 3,30 (дублет, J-19Гц, 10 В-Н), 3,07, 3,06 (2 дублета,IOA-H) 3,03 (мультиплет, з -Н), 2,69 (мультиплет, 5 -Н), 2,38 (мультиплет 8В-Н), 2,22 (мультиплет, 8А-Н), 1,84 (мультиплет, 2 -Н), 1,61 (синглет, ), 1,40, 1,39 (2 дублета, ,5Гц, 6 -Н,).

ная Группа мышей обрабатывалась даун рубицином или доксорубицином, 3 -дез амино-3 -(4 -морфолинил) даунорубиgQ цином или 3 -дезамино-З -(4 -морфолинил) -13-дигидродаунорубицином, или 3 -дезамино-З -(4-метокси-1-пипери- динил)даунорубицином или его 13-ди- гидро эквивалентом.

gc Среднее время выживания различных обработанных мышей определялось и сравнивалось со временем для мышей, инокулированных лейкемийной асцитной жидкостью, но которым не давалось

Данные ультрафиолетового спектра Vis () максимум 234 нм (40, 100), 252 (27,700), 289 (9,420),

лил)-НСН.

478 (13,000), 495 (13,000), 495 (12,900), 530 (7,190).

Масс-спектр (как производные три- метилсилила) м/е 899 М (триметилсилил)-НСН.

Вычислено,%: С 56,97; Н 5,68; N 4,16.

лил)-НСН.

N 4,20.

Найдено,%: С 57,07; Н 5,37; N 4,17.

Дальнейшее элюирование содержимого указанной колонки привело к получению 0,041 г 3 -деамино-3 -(3 -ци- ано-4 -морфолинил)- 3-дигидродоксо- рубицина.

Данные ультрафиолетового спектра Vis () максимум 234 нм () 252 (28,000), 289 (9,390), 475 (12,700), 496 (12,800), 530 (7,410).

Масс-спектр (как производные три- метилсилила) м/е 985 М (триметилси- лил)5-СН,, 973 М (триметилсилил)5-НСН.

Вычислено,%: С 57,57; Н 5,89;

,20.

1,5 Найдено,%: С 57,35; Н 5,94; N3,82.

N 4,20.

Предлагаемое соединение обладает . полезностью в качестве противоопухолевого агента для млекопитающих. Данная активность подтверждается данными исследований ин виво и ин витро. В одном из опытов ин виво, проводиMOM в соответствии с протоколом, описанным в работе Gamer Chemotherapy Reports National Gamer Institute, 3, № 2, Ч.З, от сентября 1972 г., здоровые мыши инокулировались интраперитонально асцитной жидкостью лимфоцит

лейкемия Р-388. Инокулированные мыши затем обрабатывались на 5,9 и 13 сут истекшего периода времени различными количествами предлагаемого соедине я. Для сравнения другие мыши были необработанными, а еще дополнитель-

ная Группа мышей обрабатывалась дауно- рубицином или доксорубицином, 3 -дез- амино-3 -(4 -морфолинил) даунорубицином или 3 -дезамино-З -(4 -морфолинил) -13-дигидродаунорубицином, или 3 -дезамино-З -(4-метокси-1-пипери- динил)даунорубицином или его 13-ди- гидро эквивалентом..

Среднее время выживания различных обработанных мышей определялось и сравнивалось со временем для мышей, инокулированных лейкемийной асцитной жидкостью, но которым не давалось

5I

никакого лечения испытываемым соединением.

Данные, полученные таким образом, представлены в табл.1 в виде величин Т/С которые представляют собой время выживания, обработанных мышей, де ленное на время выживания контрольных и умноженное на 100. В таблице 1 даются также уровни дозировок различ ных соединений, которые наблюдаются для получения наилучших результатов улучшения времени выживания.

Результаты показывают, что предлагаемое соединение обладает противоопухолевой активностью ин виво от хорошей до превосходной при низких оптимальных дозировках. Соединение NSC 357704 показало уровень оптиналь- ной дозы около 1/150 от дозы, требуемой в случае родительского соединения (т.е. от которого оно произошло) .

Дополнительные испытания были проведены для подтверждения биологической активности предлагаемого соединения. Это были испытания ин виво на мьшах против лейкемии Р-388 и L-1210 и Меланомы В-16, которые осуществлялись по методике работы Cancer Chemotherapy Reports, 1972. Испытывались различные дозы и 1.Р (интраперито- нальный), 1.V (внутривенный) и оральный способы приема препаратов.

Противоопухолевая активность на мьшах при оптимальной дозе (% Р/с, мг/кг) представлена в табл.2.

Новое соединение является средне- токсичным.

4022576

Формула изобретения Способ получения 3 -цианоморфоли- нопроизводного доксорубицина. формулы

О ОН

со -СНдОН

ОН

-10

HsCO

CN

отличающийся тем, что

хлоргидрат доксорубицина подвергают взаимодействию в смешанной водно-полярной органической среде с 18 моль- эквивалентами 2,2-оксидиацетальдеги- да, полученного in situ расщеплением

1,4-ангидроэритритола в водном растворе с периодатом натрия при ком- Натной температуре, в присутствии 2 моль-экзивалентов по отношению к исходному доксорубицину цианборгидрида щелочного металла, например

цианборгидрида натрия или калия, сы-. рой продукт реакции разделяют на основные и нейтральные фракции и последние хроматографируют на колонке с

силикагелем, используя в качестве элюента смесь с объемным соотношени-. ем ,,OH 99:1, CH GH/CH Cl с постепенгйм увеличением количества HjOH, до объемного соотношения 9:1

в конце элюирования.

Изобретение касается производных доксорубицина, в частности 3 -ци- аноморфолинодоксорубицина, обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание нового более активного соединения указанного класса. Его синтез ведут из хлоргидрата доксорубицина (ХР),который обрабатывают в водно-полярной органической среде 18 моль-экв 2,2-оксидиацеталь- дегида. Последующее непосредственное расщепление 1,4-ангидроэритритола в водном растворе ведут периодатом натрия при комнатной температуре в присутствии 2 моль-зкв по отношению к исходному ХР цианборгидрида щелочного металла (калия или натрия). Полу ченный сырой продукт разделяют на основные и нейтральные фракции. Последние хроматографируют на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси СН 01 -

357704

Т а

лица

0,075

0,003

0,0005

150

360291

82151

123127

3 -Дезамино-З (4 -МОРФОлИНИЛ)

даунорубицин i2475 166

/ 3 -Дезамино-З(4 -морфолинил)13-дигидродаунорубицин 327450 132

Регистрационный номер Национального института рака Национального центра услуг США.

Тавяно 2

0,2

0,021

0,0030

0,2

0,76

0,10

0,2

2,2

0,67

Соединение

285(2) 197(20)

129,146(3) 195(4) 292(4)

Примечание, ip - Введение внутрнб1яо0иняо; iv - вяутривешю;

ро - чсрея рЬт.

jd - q график приема, например q - каяюЛ 4vr аертъй день.

158(O.J)

138(0.0063)

123(0,0125)

135(0,25). 121(0,25)