Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS,используемый для получения моноклональных антител к митохондриальной креатинфосфокиназе человека Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехно- Яогии и может быть использовано для диагностики инфаркта миокарда.

Целью изобретения является полу- keHHe штамма гибридных культивируе- Цых клеток животных Mus musculus, |продуцирующего моноклональные анти- Ьеда (МКА) к митохондриальной креа- тинфосфокиназе человека (КФКмит) Штамм получают следующим образом. Мьшей линии BALB/C иммунизируют трижды по 100 мкг КФКмит в 200 мкл |забуференного фосфатами физраствора 1(ЗФР) внутрибркипинно. Через три дня |после третьей иммунизации клетки селезенки мыши с наиболее высоким титром антител в сыворотке крови ,j( 1:50000 по радиоиммунологическому Iанализу) используют для слияния 1с клетками миеломьз Х.63-Ад.8-653, : Слияние проводят при помойщ полиэти- ленгликоля мол.массы 3350, Отноше- j кие клеток спленоцитов к миломным клеткам составляет 5:1, После гибри™ дизации клеток высевают в 96-луноч- iные плашпеты по 2-10 клеток в лунку I Селеющя гибридных клеток обеспечи- I дается применением селективной среды rATsRPMl-1640 с добавлением 10% ло I шадиной, 10% телячьей эмбриональной ;i сыворотки 4, мМ 1 глютамина, 10 мМ

пирувата натрия, 100 мкг пенициллина 100 MKF стрептомицина, аминокислотами для базальной среды Игла, 0,05 мМ меркаптоэтанола, гипоксантина, 4- М аминоптериака, 1,6- 10 М ти мидина. Дальнейшее культивирование ; проводят на среде RPM1--1640,

Скрининг гибридом проводят на гибких планшетах из поливиннлхлорида методом радиоиммунологического анализа, используя меченные изотопом .

W 12.5 t

йода 1 крол1этьи антитела к иммуноглобулинам мьшш. Дважда ответившие положительно первичные популяции подвергают клонированию и реклонирова- нию, после чего 100% сублоконов продуцируют МКА к КФКмит, )

X

Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают А-КФК-5Н12. Штамм А-КФК-5Н12 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток животных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК {п).;1130 и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда культивирования - среда RPMI-1640 с 10% телячьей эбрионапьной сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мгк/мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия, аминокислота- ми для базальной среды Игла, 0,05%

меркаптоэтанола. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду, посевная доза 100000 кл/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность расс-ева 1:5, Культура суспензионная. Клетки культивируют при / 37 С в атмосфере 5% СО, Для выращивания опухоли пригодны мыши линии BALB /C, которым не менее чем за три дня до инъекции штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Штамм вводят внутрибрюшинно по 3 10 клеток на мьш1ь в I мл среды RPM1-1640, Асцитная опухоль развивается через 15-20 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция МКА на третий день культивирования составляет 50 мкг/мл среды. Содержание МКА в асцитичес кой жидкости 5-10 мг/мп. Стабильная

продукция антител сохраняется до I1 пассажей in vitro,с

Характеристика полезного продукта.

МКА относятся к классу д GI, они

специфически связываются с КФКмит, Контаминация, Бактерии и грибы не обнаружены

при длительном наблюдении в культуре при посевах на питательные среды,

Заражения микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке культуральной

среды.

Криоконсервирование,

2-5-10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотке с добавлением 10% диметил- . сульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание проводят в программном

замораживателе по следующей программе: 4° мин до 4 с и по 1 С мин до , после чего переносят в жидкий азот для хранения. Размораживание, проводят быстро при 37°С в водной

бане. Жизнеспособность 1слеток после размораживания по включению трипако- вого синего - 60-70%.

Пример 1. В каждую лунку 96- луночного планшета из полистирола

(ИФМА) или полихлорвинила (РИА) вносят мкг антигена в 100 мкл ЗФР и инкубируют ночь при 4 С, после чего промывают четыре раза 0,05%-ным раствором Твин/а 20 в ЗФР, и оставляют планшет на I ч при комнатной тем-, пературе под этим раствором, затем его сливают и в лунки вносят антитела на 1 ч. После инкубации раствор антител сливают, промывают четыре раза Твин ом в ЗФР и вносят проявляющие поликлональные антитела кролика к иммуноглобулинам мыши, ковалентно связанные с пероксидазой хрена ДИФМА) или радиоактивно меченные изотопом йода I (РИА). Результаты оценивают по интенсивности окраски в лунках после добавления субстрата пероксида- зы - перекиси водорода в присутствии ;хромогена - ортофенилендиамина при проведении ИФАМ и при помощи гамма- счетчика при постановке РИА,

Результаты опыта по изучению спе- цифич ности связывания МКА с КФКмит приведены в таблице,

В каждую лунку вносят антитела кролика к иммуноглобулинам мыши с ра- диоактивностью 5,7-10 распадов в минуту. Фон, т.е. лунки, где вместо антител вносят 0,2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина - Г 500 расп/мин, В качестве контроля используют штамм 4Н8, синтезирующий антитела к другому антигену (ЛПНП)

Результаты, представленные в таблице свидетельствуют о высокой, специфичности взаимодействия получен ных МКА с КФКмит.

П ри ме р 2. Для количественного определения содержания в растворе КФКмит, используя МКА постановку, осуществляют при помощи ИФМА, а именно используя конкурентный метод. На по-

листироловый планшет наносят МКА к КФКмит после четырех промывок (0,05 Твин 20 в ЗФР), блокируют свободную поверхность пластика 0,2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в ЗФР и вносят смесь КФКмит и КФКмит, коньюгированной с пероксидазой хрена. Чем выше содержание КФКмит в тестируемом растворе, тем ниже интенсивность окраски в лучке после добавления субстратной смеси. КФКмит титруют на фоне пулированной сыворотки крови здоровых доноров, Результаты отношением В/Ву ;Где В - интенсивность окраски п-ри различных количествах КФКмит в про- ,бе, BQ - интенсивность окраски в пробе, где КФКмит не внесена (при

71 492 нм, BO 0,35): Количество КФКмит, ., В/В, нг 100 ,мкл

4000,000,09

800.000,32

160.000,59

32.000,78

6,40-0,86

1,280,94

0.001,00

Результаты, представленные в таб лице 2, подтверждают высокую специ- .фичность взаимодействия полученных МКА с КФКмит в растворе, что позволяет использовать МКА для клинических определений в случае подозрения миокарда.

Формула изобретени

Штамм гибрид11ых культивируемых клеток животных Низ musculus ВСКК(П) № il3D, используемый дпя получения моноклональных антител к митохондриальной креатинфосфокиназе человека.

f. V

Изобретение относится биотехнологии и может быть использовано для диагностики инфаркта миокарда. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS mu scuJuSi продуцирующего моноклональные антитела {МКА) к митохондриальной креатинфосфокина- зе человека (КФКмит). Штамп получают, гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных КФКмит, с клетками миеломы Х63-Ад«8-653. Клетки штамма культивируют- в среде RPMI-1640 с 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10% лошадиной сыворотки при 37 С в атмосфере 5% 00. Продукция МКА на третий день культиви- рования составляет 50 мкг/мл. жание ША в асцитической жидкости 3-10 мг/мл. Препараты на основе МКА могут быть использованы для определения КФКмит в сыворотке крови больных при :дагностике инфаркта миокарда. 1 табл. (Л