Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый для получения моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека Советский патент 1987 года по МПК C12N5/00 

.

Р

113

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в Медицине и экспериментальной биологии.

Цель изобретения - получение штам ма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, используемый для получения моноклональных антител (№АТ) к определенному эпитопу ангио тен.зин превращающего фермента лег - ких человека (АПФ).

Штамм получают следующим образом.

Мьшей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшным введением 80 мкг ангио тензин-превращающего фермента, вьще пенного из ткани легких человека, в 0,2 МП забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), содержащем 30% полного адъюванта Фрейнда. Через 10 дн иммунизацию повторяют введением внут рибрюшинно 60 мкг антигена в ЗФР без адъюванта. Через неделю мышам вводят 60 мкг фермента внутривенно в объеме 50 мкг. Мере три дн после этого 15х х10 клеток селезенки иммунных мышей гибридизуют с 5x10 клеток миеломы мьш1и Х63-А 8-653 в присутствии 0,7мл раствора, содержащего 45% (объем/ /объем) полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. мйс. 3350 и 15% диметилсульфоксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели по 2х х10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов использу- ют среду .RPM1-1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% телячьей эмбриональной сыворотки, гипоксантина, аминонтерина и 1, мидина. Гибриды-продуценты клонируют два раза методом конечных разведений высевая по одной клетке в лунку,содержащую 4x10 клеток селезенки, После клонирования практически 100% сублонов продуцируют антитела к ангиотензин-превращающему ферменту.

Продуктивные клоны обозначают A-ACE-5F1.

Штамм A-ACE-5F1 хранится в специа лизированной коллекции перевиваемых Соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 27 D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда для культивирования - среда RPM1-1640 с добавлением 10% эмбриональной теля52

чьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, 4 m М L-глютамина, 10 m М пи- рувата натрия, 100 мкг-/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокислот для базальной среды Игла,витаминов для среды Игла и 0,05 т М меркаптоэтанола.

Кпетки культивируют при 37°С в атмосфере 5% COj. Посевная доза 100 тыс. клеток/мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дн, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная о Для выращивания гибридомы в орг аниз- ме животных клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/c в количестве 2-5-10 клеток- на мышь. Асцит образуется через 12-16 дн.

Штаммы в организме животных не перевивали .

Продуктивность штамма. Продук1и1я моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет 45-55 мкг /мл культуральной жидкости и 6-8 мкг /мл асцитической жидкости. Продукция антител в культуре сохраняется на протяжении восьми пассжей.

Характеристика моноклональных антител. Антитела,относятся к классу IgGj .Они специфически взаимодействуют с определенным эпитопомАПФ.Специфичность взаимодействия определяется с помощью твердофазного иммуноферментного метода (EL1SA) и теста на обог ащение.

Контаминация. Бактерии и грибы

в культуре не обнаружены при длителном наблюдении и посевах на питательные среды,. Заражение микоплаз- мой не выявлено при окраигивании красителями на ДНК и тимидиновой метк культуральной среды.

Криоконсервирование. 1-5-10 дле- ток штамма консервируют в 1 мл те- льячей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида -В пластиковых, ампулах. Замораживание проводят в программном замора- живателе по следующей программе: температуру снижают по 4 С в 1 мин до С и по в 1 мин до - 40°С. Клетки хранят в жидком азоте.Размораживание : быстро при 37 С. Жизнеспособность после размораживания составляет 70-80%.

Пример 1. Гибридные к.ттетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5x10 в 5 мл среды RPM1-1640 с 10% эмбриональной ТРЛЯчьей сыворотки. 10% лошадиной сыворотки, 4 m М глютамина, 10 m М пиру- вата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 m М меркаптоэтанола. Клетки культивиру- ют 3-4 дн при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО. Культуральную среду собирают, центрифугируют в течение 10 мин при 800 g и . Полученный супер атант используют как реагент для изучения специфичности взаимодействия антитела с ангиотензин- превращающим ферментом легких человека с помощью ELISA-метода.

На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют А11Ф-1 в 50 мкл карбонатного буфера (100 m М рН 9,6) при 4°С в течение .ночи. После насыщения панели отмывают О,2%-ным раствором бычьего сы- вороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком в ячейки панели вносят 50 мкл культуральнрй среды штамма A-ACE-5F1 (на 1 ч при 37°С). После этого панель отмывают четыре раза по 100 мкл ЗФР с О,2%-ным раствором БСА и 0,05%-ным раствором Твин-20 и вносят конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мы- ши, ковалентно связанньк с перокси- дазой (на 1 ч при 37°С). После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а связавшуюся, пероксида- ЗУ, а значит, и антитела против АПФ определяют количественно по расщеплению субстрата (Н,0) в присутствии хромогена-ортофенилендиамина.Положительная реакция проявляется коричне- вым окрашиванием и просчитывается при 490 нм.

Результаты опыта по изучению специфичности связывания иммуноглобулинов- из культуральной среды штам- ма A-ACE-5F1 с АПФ легких человека сорбированном на пластике, представлены в табл. 1 (приведенные данные - среднее из трех независимых значенирЙ

Результаты представленные в табл. 1, свидетельствуют о высокой специфичности моноклональных антител, вырабатываемых клетками штамма A-ACE-5F1.

Пример 2. На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши : 100 мкл

на ячейку в концентрации 20 мкг/мл (при °С на ночь), затем после забивки плашки О,2%-ным раствором БСА в ЗФР для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком сорбируют иммуноглобулины мыши из культуральной среды от клеток штамма A-ACE-5F1, полученной по примеру 1. После отмывки панели О,2%-ным раствором БСА в ЗФР от несвязавшихся иммуноглобулинов в ячейки вносят раствор .АПФ (100 мкл, концентрация фермента 7 ). АПФ, связавшийся с мо- ноклональным антителом, вьфабатыва- штаммом A-ACE-5F1, определяют количественно в ячейках для микротитрования с помощью флуоресцентного метода, используя в качестве субстрата Hip-His-Leu.

Результаты опыта по изучению специфичности взаимодействия МкАТ, вырабатываемых клетками штамма А-АСЕ- 5F1 с АПФ в растворе, приведены в табл. 2.

Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о высокой специфичности моно1спональных антител, вырабатываемых клетками штамма A-ACE-5F1 по отношению к АПФ, и показывают возможность их применения для выявления АПФ в растворах (биологических жидкостях, экстрактах т каней и т.д.). Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculUs ВСКК(П) № 27 D (специализированная коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР), используемый для получения моноклональ- ных антител к ангиотензин- превращающему ферменту легких человека.

Таблица 1

50 Штамм A-ACE-5F1

1

0,78

55

1:10 0,72 1:100 0,54

1:1000 О,13

Продолжение табл.1

2

3

Штамм 8G4, выраба- 1 0,09

тывающий МкАТ про-

тин липопротеидов 1:10 0,07

низкой плотности из

плазмы человека 1 0,08

0,2%-ный раствор БСА

Если вместо АПФ в ячейке сорбирован БСА, то количество иммуноглобулинов из штамма A-ACE-5F1, сорбированных на БСА и выявляемых методом EL1SA, находится на уровне негативного контроля.

Таблица2

Составитель М.Серова Редактор А.Козориз Техред Л.Сердюкова Корректор. С.Шекмар

Заказ 1774/21 Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, , Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Продолжение табл.2

Штамм 8G4, вьфабатывающий антитела против липопротеидов низкой плотности из плазмы человека, 0,2%-нь1й раствор БСА в ЗФР

0,324

25

Среднее из трех независимых опре- ,делений.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной био- лот ии. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus,.продуцирующих моноклональные .антитела (МкАТ) к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека (АПФ).Штамм A-ACE-5F1 получают гибридизацией иммуннь1х клеток селезенки мышей BAIjB/ /с с клетками миеломы X63-Ag8-653. Он хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)27Д. Клетки штамма культивируют на среде RPM1-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, кратность рассева 1:10 - 1 раз в 3-4 дня. При введении 2-5-10 клеток в брюшную полость мышей BALB/C асцит образуется через 12-16 дн. Продукция МкАТ составляет 45-55 мкг/мл культураль- ной жидкости и 6-8 мкг/мп асцитичес- кой. МкАТ относятся к классу JgGj.. Они специфически взаимодействуют с определенным эпитопом молекулы АПФ и используются для выявления его на срезах тканей, мембране клеток,биологических жидкостях и т.д. 2 табл. (О СЛ I о 00 Oi N3 СП