Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый для получения моноклональных антител к ангиотензинпревращающему ферменту легких человека Советский патент 1987 года по МПК C12N5/00 

I13

Изобретение относится к биотехно- логии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии.

Целью изобретения является полу- чени е штамма гибридных культивируемых клеток мьши Mus musculus, используемого для получения моноклональных антител к определенному эпитопу ан гиотёнзинпревращающего фермента легких человека (АПФ).

Штамм получают следующим образом.

Мьшей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинным введением 80 мкг ангиотензинпревращающего фермента, вьщеленного из ткани легких человека, в 0,2 мл забуференного фосфатами физраствора (ЗФР), содержащего 30% полного адъюванта Фрейнда. Через 10 дней иммунизацию повторяют введением внутрибрюшинно 60 мкг антигена в ЭФР без адъюванта. Через неделю мышам вводят 60 мкг фермента внутривенно в объеме 50 мкг. Через 3 дня после зтого 15x10 клеток селезенки иммунных мьш1ей гибридизуют с 5х 10 клеток миеломы мьши X63-Ag8-653 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45% (объем/объем) полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. массы 3350 и 15% ди- метилсульфоксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГ клетки высевают в 96-луночные панели по 2x10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPM1-1640 с добавлением 10%-ной лошадиной и 1Ь%-ной телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксантина, 4x10 М аминонтерина и 1,6x10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по I клетке в лунку, содержащую 4x10 клеток селезенки. После 2-го клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к.ангиотензинпревращающему ферменту. Продуктивные клоны обозначают А-АСЕ-9В9.

Штамм А-АСЕ-9В9 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых самотических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) № 28 D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда для культивирования - среда RPM1-164D с добавлением 10%-ной телячьей эмбриональной сыворотки и 10%-ной лошадиной

32

сыворотки, 4 |UM L-глютамина, 10 щ М пирувата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, обогащенная аминокислотами для базальной

среды Игла, витаминами для среды Игла и О,05 р М меркаптоэтанола.

Клетки культивируют при З7 с в атмосфере 5% СО. Посевная доза 100 тыс.кл./мл, клетки пассируют I раз

в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная. Штамм продуцирует антитела на протяжении 8 пассажей в культуре.

Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/c, обработанных пристаном, в количестве 2-510 клеток на мьш1ь. Асцит образуется через 12-16 дней. Штамм на животных не пе

ревивают.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 3-4-й день культивирования составляет 15-20 мкг/

/мл культуральной жидкости и 4-6 мг/ /мл асцитической жидкости.

Характеристика моноклональных антител .

Моноклональные антитела относятся

к классу IgGy, . Они специфически взаимодействуют с определенньм эпитопом ангиотензинпревращающего фермента легких человека. Специфичность оценивается с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ELISA) и теста на обогащение.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке культу- ральной среды.

Криоконсервирование. 1-5-10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с до- бавпением 10% диметилсульфоксида. Температуру снижают по.4°С в минуту

до 4 и по 1 С в минуту до -40 С.

Клетки хранят в жидкЪм азоте. Жизнеспособность после размораживания составляет 70-80%.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5x10 в 5 мл среды RPM1-1640 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 10%-ной лошадиной сывороткой, 4 JU М глютамина, 10 К М пирув.ата натрия, 100 мкг/мл

31

пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 ц М меркаптоэтанола. Клетки культивируют 3-4 дня при в атмосфере, содержащей 5% СО. Куль- туральную среду собирают, центрифу- гируют в течение J О мин при 800g и 4 С. Полученный супернатант используют как реагент для изучения специфичности взаимодействия антитела с ангиотензинпревращающим ферментом легких человека с помощью ELISA-ме- тода.

На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования собирают АПФ - 1 мкг на ячейку в 50 мкл кар- бонатного буфера (100 |Ц М, рН 9,6) при 4 С в течение ночи. После насыщения панели 0,2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифического свя- зывания антител пластиком в ячейки панели вносят 50 мкл культуральной среды штамма А-АСЕ-9В9 (на 1 ч при 37 С). После этого панель отмывают 4 раза по 100 мкл ЗФР с О,2%-ным БСА и 0,05%-ным Твин-20 и вносят конъю- гат антител кролика против иммуноглобулинов мыши.ковалентно связанных с пероксидазой (на 1 ч при 37 С После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а связавшуюся пер сидазу, а значит и антитела против АПФ, определяют количественно по ращеплению субстрата () в присут- ствии хромогена - ортофенилендиамин Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывется при 490 нм.

Результаты опыта по изучению спе цифичности связывания иммуноглобулинов из культурал ьной среды штамма А-АСЕ-9В9 с АПФ легких человека, собированном на пластике, представлен в табл. 1 (приведено среднее из тре независимых определений).

Таблица

А-АСЕ-9В9 1

1:10 1:100

0,70 0,39

0,25

Продолжение табл.Г

1:1000

1:10

1

0,13

0,09 0,07 О „08

5 0 5

0

0

Если вместо АПФ в ячейке сорбирован БСА., то количество иммуноглобулинов из штамма А-АСЁ-9В9, cop6:-ipo- ванных на БСА и выявленных методом ELISA, - на уровне негативного контроля .

Результаты, приведенные в табл, 1, свидетельствуют о высокой специфичности моноклонального антитела, вырабатываемого клетками штамма А-АСЕ 9В9, к АПФ легких человека.

Пример 2. На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши: 100 мкл на ячейку в концентрации 20 мкг (пои 4 С на ночь), затем после забнвки плашки 0,2%-ным раствором БСА в ЗФР для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком сорбируют иммуноглобулины мьши из культуральной .среды от клеток штамма А-АСЕ-ЭВЭ, полученной как указано в примере . После отмывки панели О,2%-ным раствором БСА в ЗФР от несвязавшихся иммуноглобулинов в ячейки вносят раствор АПФ (100 мкл, концентрация фермента 7 мкл/мл). АПФ, связавшийся с моноклональным антителом, вырабатыва- емь1м штаммом А-АСЕ-9Б9, определяют количественно в ячейках для мпсро- титрования с помощью флуоресцентного метода, используя в качестве суб- страта Hip-His-Leu.

Результаты опыта по изучению спе- 5 цифичности взаимодействия МкАТ, вы- рабатываемых клетками штамьш А-АСЕ- 9В9 с АПФ в растворе, представлены в табл. 2 (приведено среднее кз трех независимых определений).

5

Т а б

лица 2

1

1 1

1 1;

1

10

100

1000

10

7,82 6,37 2,77 0,84 0,330

0,340

0,324

Составитель М. Серова

Редактор Н.Егорова1 ХЕ Б 9Р1.. Корректор Л. Па тай

Заказ 2316/26 Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1315473

Результаты, приведенные в табл.2, свидетельствуют о высокой специфичности монокпональных антител, вырабатываемых клетками штамма А-АСЕ-9В9 по отношению к АПФ, и показывают возможности их применения для выявления АПФ в растворах (в биологических жидкостях, зкстрактах тканей и т.д.).

ГО ф

о р м у ла изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus ВСКК (П) № 28D (специализированная коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР), используемый для получения монокло- нальных антител к ангиотензинпревра- щающему ферменту легких человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в биологии и экспериментальной медици.- не. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых юцеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела к определенному эпитопу ;ангиотензинпревра щающего фермента легких человека (АПФ). Штамм А-АСЕ-9В9 получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALE/с клетками миелоны Х63-А 8-653. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 28D Клетки культивируют на среде РРМ1-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки при 37 С в атмосфере 5% COj. Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Секреция моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной жидкости и 4-6 мг/мл асцитической жидкости. Моноклональные антитела относятся к классу IgG( . Они используются для выявления АПФ на срезах тканей, культивируемых клетках, биологических жидкостях и т.д. 2 табл. § (Л со сд СО