Штамм гибридных культивируемых клеток мыши @ @ ,используемый для получения моноклональных антител к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека Советский патент 1987 года по МПК C12N5/00 

113

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии

Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела к одному эпитопу ангиотензин- превращающего фермента легких человека (АПФ).

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинным введением 80 мкг ан- гиотензин-превращающего фермента.

10

Посевная доза 10 кл/мл клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная Для выращивания гибридом в асцит- ной форме клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/c, обработанных пристаном, в количестве 2-510 клевыделенного из ткани легких человека, ,5 образуется через в 0,2 мл забуференного фосфатами физ- животных штамм не перевивают. К моменту депонирования он проходит 8 пассажей в культуре.

20

раствора (ЗФР), содержащего 30% полного адъюванта Фрейнда. Через 10 дней иммунизацию повторяют введением вну- трибрюшинно 60 мкг антигена в ЗФР без адъюванта.

Через неделю мышам вводят -60 мкг фермента внутривенно в объеме 50 мкг. Через 3 дня после этого 15-17 клеток селезенки иммунных мышей гибридизиру- 25 ют с 5-10 клеток миеломы М1зши X63-Ag8-653 в присутствии 0,7 мл раствора, содержащего 45,% (об./об.) полиэтиленгликоля (ПЭГ) .мол. массы 3350 и 15% диметилсульфоксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от ПЭГ клетки высевают в 96 луночные панели - по 2-10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% лошадиной и

10% телячьей эмбриональной сыворотки, иГ М гипоксантина, 410 М аминоптерина,и 1,6-10 М тимидина.

Гибриды - продуценты клонируют два раза методом конечных разведений высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 410 клеток селезенки. После

ревивают. К моменту депонирования он проходит 8 пассажей в культуре.

Продуктивность штамма. На 3-4 ден культивирования штамма секреция мо- ноклональных антител составляет 30- 40 мкг/мл культуральной жидкости и 5-6 мг/мл асцитической жидкости.

Характеристика полезного продукта

Моноклональные антитела относятся к классу IgGj . Они специфичны к определенному эпитопу ангиотензии-пре- вращающего фермента.

Методы оценки специфичности мо- ноклональных антител: твердофазный иммуноферментный анализ и тест на обогащение.

Контаминация штамма. Бактерии -и грибы в культуре не обнаружены. Заражение микоплазмой не выявляют при окрашивании красителями на ДНК и ти мидиновой метке культуральной среды.

КриоконсерБШрование. 1-5. 10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добав лением 10% диметилсульфоксида. Температуру снижают по 4 С в 1 мин до 4 С и по 1 С в 1 мин до -40 С.Клет30

35

второго клонирования практически 100%

ки хранят в жидком азоте. Жизнеспо,,собность после размораживания соссубклонов продуцируют антитела к ан- лг , „,.„

- тавляет 70-80%.

гиотензин-превращающему ферменту. Продуктивные клоны обозначают A-ACE-3G8.

Штамм A-ACE-3G8 хранится в Специi

Штамм A-ACE-3G8 используют следующим образом.

Пример 1. Гибридные клетки

ализированной коллекции перевиваемых Q помещают в пластиковый флакон пло- соматических клеток позвоночных Ин- щадью 25 см по 510 в ститута цитологии АН СССР, под номером ВСКК(П) 26D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Среда для культивирования - среда RPMI с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной, 4 мМ глюта- мина, 10 мМ пирувата натрия,100 мкг/мл

щадью 25 см по 510 в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 10% лошадиной сыв роткой, 4 тпМ глютамина, 10 пМ пиру- вата натрия, 100 мкг/мл пенициллина 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 гаМ меркаптоэтанола. Клетки культивируQ

ют 3-4 дня при 37 С в атмосфере, со держащей 5% СО. Культуральну1р сред

пенициллина, 10 мкг/мл стрептомицина, аминокислот для базальной среды. Игла, витаминов для среды Игла иО,051 меркаптоэтанола,

Культивирование штамма ведут при 37 С в атмосфере 5% углекислоты.

Посевная доза 10 кл/мл клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная. Для выращивания гибридом в асцит- ной форме клетки вводят в брюшную полость мышей BALB/c, обработанных пристаном, в количестве 2-510 кле ° образуется через животных штамм не пе

ревивают. К моменту депонирования он проходит 8 пассажей в культуре.

Продуктивность штамма. На 3-4 день культивирования штамма секреция мо- ноклональных антител составляет 30- 40 мкг/мл культуральной жидкости и 5-6 мг/мл асцитической жидкости.

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела относятся к классу IgGj . Они специфичны к определенному эпитопу ангиотензии-пре- вращающего фермента.

Методы оценки специфичности мо- ноклональных антител: твердофазный иммуноферментный анализ и тест на обогащение.

Контаминация штамма. Бактерии -и грибы в культуре не обнаружены. Заражение микоплазмой не выявляют при окрашивании красителями на ДНК и ти- мидиновой метке культуральной среды.

КриоконсерБШрование. 1-5. 10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добав- лением 10% диметилсульфоксида. Температуру снижают по 4 С в 1 мин до 4 С и по 1 С в 1 мин до -40 С.Клет

i

Штамм A-ACE-3G8 используют следующим образом.

Пример 1. Гибридные клетки

Q помещают в пластиковый флакон пло- щадью 25 см по 510 в

щадью 25 см по 510 в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 10% лошадиной сывороткой, 4 тпМ глютамина, 10 пМ пиру- вата натрия, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 гаМ меркаптоэтанола. Клетки культивируQ

ют 3-4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5% СО. Культуральну1р среду

собирают, центрифугируют 10 мин при 800 q и 4 С. Полученный супернатант используют как реагент для изучения специфичности взаимодействия антител с ангиотензин-превращающим ферментом легких человека с помощью метода ELISA.

На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют ЛПФ (1 мкг на ячейку) в 50 мкл кар- бонатного буфера (100 тМ, рН 9,6) при 4 С в течение ночи. После насьще- ния панели промывают 0,2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для уменьшения неспецифи- ческого связывания антител пластиком, в ячейки панели вносят 50 мкл культуральной среды штамма A-ACE-3G8 Инкубирование ведут в течение 1 ч при 37 С. После этого панель отмывают 4 раза по 100 мкл ЗФР с 0,2% БСА и 0,05% Твин-20 и вносят коньюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалентно связа нных с пероксидазой. После окончания инкубации (1 ч при 37 С) несвязавшиеся продукты реакции отмывают описанным способом, а связавшуюся пероксидазу, а значит и антитела против АПФ определяют количественно по расщеплению субстрата () в присутствии хро- могена-ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при 490 нм.

Результаты опыта по изучению специфичности связывания иммуноглобулинов из культуральной среды штамма A ACE-3G8 с АПФ легких человека, сорбированном на пластике, представлены в табл.1 (приведенные цифры среднее из трех определений),о

Т а б л и ц а 1

Штамм A-ACE-3G8

Продолжение табл,1

н

10

0,09 0,07

0,2%-Т1ый раствор БСА в ЗФР

0,08

W 5 20

Если вместо АПФ в ячейке сорбирован БСА, то количество иммуноглобулинов из штамма A-AGE-3G8, сорбированных на БСА и выявляемых методом ELISA, на уровне негативного контроля.

25 Результаты, приведенные в табл.1, свидетельствуют о высокой специфичности моноклокальных антител, вырабатываемых клетками штамма A-ACE-3G8 к АПФ, и показывают возможность при30 менения антител для выявления иммобилизованного АПФ (на срезах тканей, на культивируемых клетках и т.д.) с помощью твердофазного иммунофермент- ного или радиоиммунного метода.

Пример 2. На полистироловую 96-ячеечную панель для микротитрования сорбируют антитела кролика против иммуноглобулинов мьш1И (100 мкл на ячейку) концентрации 20 мкг/мл (при 4с, на ночь). Затем после забивки плашки 0,2%-ным раствором БСА в ЭФР, для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком, сорбируют иммуноглобулины мыши из

45 культуральной среды от клеток штамма A-ACE-3G8, полученной как указано в примере 1. После отмывки панели 0,2%-ным раствором БСА в ЭФР от не- ; связавшихся иммуноглобулинов в ячейки

0 вносят раствор АПФ (100 мкл, концентрация фермента 7 мкл/мл). АПФ, связавшийся с моноклональным антителом, вырабатываемым штаммом A-/.CE-3G8, определяют количественно в ячейках

5 для микротитрования с помощью флуоресцентного метода, используя fe качестве субстрата Hip-His-Leu.

Результаты опыта по изучению специфичности в&аимодействия МкАТ, вы35

40

51312097

рабатываемых клетками штамма А-АСЕ- -3G8 с АПФ в растворе, приведены в табл.2.

Таблица 2

Штамм A-ACE-3G8

0,330

Редактор Н.Гунько

Составитель М.Серова Техред А.Кравчук

Заказ 1935/24Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Продолжение табл,2

1:10

0,2% БСА в ЗФР 1

0,340 0,324

среднее из трех независимых определений.

Результаты, приведенные в.табл.2, свидетельствуют о высокой специфичности моноклональньгк антител, выра- батываемых клетками штамма A-ACE-3G8, по отношению к АПФ и показывают возможности пр именения их для выявления АПФ в растворах (в биологических жидкостях, экстрактах ткани и т.д.).

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши M.us musculus BGKK (П)

№ 26D (Специализированная коллекция перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР), используемый для получения моноклональных антител к ангиотезин-превращающему ферменту легких человека.

Корректор С.Черни

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и экспериментальной биологии. Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела к ангиотензин-превращающему ферменту легких человека (АПФ). Штамм получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALB/c с клетками миеломы X63-Ag8-653. Селекцию гибридов ведут на среде HAT и клонируют методом конечных разведений. Продуктивные клоны обозначают A-ACE-3G8. Штамм A-ACE-3G8 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 26D. Клетки культивируют на среде RPMI с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной при м 5% СО, . Клетки пассируют 1 раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная. Концентрация моноклональных антител составляет 30-40 мкг/мл культу- ральной жидкости и 5-6 мг/мл асцити- ческой. Моноклональные антитела относятся к классу IgGj . Они используются для выявления АПФ на срезах тканей, культивируемых клетках, биологических жидкостях и др. методами твердофазного иммуноферментного анализа, методом обогащения и др. 2 табл.