Способ получения иммобилизованного @ -Химотрипсина Советский патент 1988 года по МПК C12N11/14 B01J20/10 

сл

с

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммобилизации с -химотрипсина для получения стабильных и активных препаратов этого фермента. Цель изобретения - повышение содержания иммобилизованного /-химо- трипсина в расчете на 1 г носителя. Способ заключается в введении Дополнительной стадии - гидроксилирования силохрома 10-15%-ной соляной кислотой в аппарате Сокслета, которую проводят перед обработкой силокрома парами тетрахлорида титана и водой и адсорбцией фермента. Гидроксилирование проводят для увеличения содержания гид- роксильных групп до 0,8-1,1 ммоль на 1 г носителя. Содержание фермента на носителе возрастает л/в 2 раза. 9

4;;

о

О)

Од N9

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к иммобилизации с(химотрипсина для получения стабильных и активных препаратов этого фермента.

Цель изобретения - повышение содержания иммобилизованного о -химо- трипсина в расчете на 1 г носителя.

Способ заключается в введении дополнительной стадии обработки сило- хрома - гидроксилирования, которую проводят перед обработкой силохрома парами тетрахлорида титана и водой. Гидроксилирование осуществляют 15- 20%-ным раствором соляной кислоты в воде с помощью аппарата Сокслета, После гидроксилирования в силохроме увеличивается содержание гидроксиль- ных групп до 0,8-1,1 ммоль на 1 г носителя .

В реакцию гидроксилирования вступают силоксановые связи силохрома, как правило, менее активные в поверхностных реакциях, чем силанольные..

Использование в качестве катализатора соляной кислоты обеспечивает более эффективное течение реакции с образованием переходного комплекса, чем при использовании других неорганических кислот, поскольку сравнительно малые геометрические молекулы НС1 позволяют осуществлять транспорт реагента к трудно доступным участкам поверхности, кроме того, под действием соляной кислоты происходит большая протонизация поверхности, в результате образуются дополнительные силанольные группы - центры хемосорбции тетрахлорида титана,воды и ферментов. Содержание иммобилизованного фермента при применении предлагаемого способа возрастает г./ в 2 раза.

Пример 1.2г сипохрома обрабатывают хлороформом в аппарате Сок- слета в течение 5 ч. После этого образец тщательно высушивают и обрабатывают в аппарате Сокслета 15%-ным раствором соляной кислоты в воде в течение 4ч при 100°С. Далее образец промьгоают водой до отсутствия кислой реакции в промывных водах и сушат при . Концентрация ОН-группы на поверхности составляет 1,1 ммоль/г. Образец обрабатьшают парами четырех- хларистого титана в течение 3 ч при 180°С в токе осушенного газа-носителя (воздух, аргон). Затем в течение 2 ч проводят удаление непрореагировавших паров чет)феххлористого титана и хлористого водорода, после чего продукт обрабатывают парами воды в течение 4 ч.

Адсорбцию в/ -химотрипсина проводят из раствора фермента в фосфатном буфере (концентрация фермента 5 мг/мп) в течение 2ч, после чего образец

Q промывают фосфатным буфером и раствором Хлорида калия (0,1 ). Концентрация адсорбированного w -химотрипсина составляет 45,7 мг/г.

При проведении процесса адсорбци5 онной иммобилизации соотношение белок/носитель составляет 75 мг белка на 1 г носителя. Объем введенного в реакционную смесь белка 225 мг, степень связывания белка при проведении

0 процесса /5 0,63.

Протеолитическая активность натив- ного и иммобишизованного с/ -химотрипсина в реакции протеолиза гемоглобина, определенная по методу Ансона,

5 составляет соответственно 517 и . 388 Е/г. Таким образом, полученный гетерогенный катализатор сохраняет большую часть исходной активности (75%), что является высоким показателем для катализаторов такого типа.

Пример2, Получение 3 г силохрома, содержащего на поверхности оксид титана, проводят по примеру 1.

Адсорбцию 0 -химотрипсина проводят из раствора фермента в фосфатном буфере, исходная концентрация фермента 4,5 мг/мл, соотношение белок/носитель составляет 67 мг фермента на 1 г носителя, общее содержание фермента в растворе 200 мг. Процесс-адсорбции проводят в течение 2 ч, после чего образец промывают фосфатным буфером и раствором калий хлор (0,1 М). Концентрация адсорбированного (-химотрипсина составляет 30 мг/г, степень связывания фермента в данном случае р 0,45. При концентрации фермента в растворе менее 5 мг/мл .достижение положительного эффекта невозможно.

П р и м е р 3. Получают 3 г силохрома с титаноксидным слоем на поверхности по примеру 1.

При проведении адсорбции d -химотрипсина концентрация исходного раст5 вора фермента в фосфатном буфере составляет. 7 мг/мл, т.е. 101 мг белка на 1 г носителя при общем объеме белка в растворе 303 мг. После 2-ча0

5

0

5

0

31

совой сорбции о( -химотрипснна образе промывают 0,1 М КС1. Концентрация адсорбированного фермента составляет 45,8 мг/г, /5 0,45. Уменьшение степени связывания фермента в данном случае по сравнению с условиями иммобилизации примера 1 показывает неце- лесообразность увеличения концентрации белка в исходном ра.створе вьше 5 мг/мл и соотношения белок/носител выше 75 мг на 1 г носителя.

ПримерА. Зг силохрома обрабатывают хлороформом в аппарате Сок- слета в течение 5 ч. После сушки об- разца при 200°С определяют исходное количество гидроксильных групп поверхности - 0,6 ммоль/г. После проведенного синтеза титаноксидного сло и адсорбции о -химотрипсина (по при- меру 1) определяют концентрацию иммобилизованного фермента - 24 мг/г, степень связывания в этом случае PI 0,32. Стадия гидроксилирования относится к существенным отличительным признакам предложенного решения, так как ее исключение (в данном примере) не позволяет достигнуть положительного эффекта.

35

Пример5. Зг силохрома обра- зо Фермента 45,8 мг/г, уЗ 0,63. батывают хлороформом в аппарате Сок- Пример9. Зг силохрома обра- слета в течение 5 ч. После этого об- батьшают хлороформом в аппарате Сок- слета в течение 5ч. После просушки образец помещают в раствор соляной кислоты на 4 ч при 70°С в водяной бане. Образец промывают водой и сушат при 200 С. Концентрация ОН- групп на поверхности 0,7 ммоль/г. После этого проводят синтез титаноксидного слоя и адсорбцию о -химотрип- сина по примеру 1. Концентрация фермента на поверхности составляет 28,8 мг/г, /3 0,39. Проведение стадии гидроксилирования целесообразно Пример 6. 3 г силохрома обра-45 , лишь в этом случае можно батывают хлороформом в течение 5 ч. достигнуть положительного эффекта i.- После этого образец просушивают и об- изобретения, рабатывают 15%-ным раствором HjS04

разец просушивают и обрабатывают в аппарате Сокслета 8%-ным раствором НС1 в течение 4 ч при . Образец промывают водой и сушат при . Концентрация ОН-групп на поверхности составляет 0,7 ммоль/г. После проведения синтеза титаноксидного слоя и адсорбции о(-химотрипсина получают катализатор, содержащий на поверхности фермент 30 мг/г. Степень связывания фермента /1 О, 40.

40

в течение 4 ч ,при кипячением на водяной бане. Образец промывают водой и сушат при 200°С. В данном случае на поверхности содержание ОН- групп составляет 0,7 ммоль/г. Синтез гетерогенного катализатора проводят путем модификации титаноксидным слоем и адсорбции о(-химотрипсина по примеру 1. Концентрация фермента на поверхности составляет 31 мг/г, степень связьшания ft 0,41.

Аппарат Сокслета позволяет проводить интенсивную обработку дисперсноgg го образца, имеющего большую удельную поверхность, потоком свежепере- гйанного раствора.

Испарительная колба, содержащая раствор НС1, соединяется с холодильником, в котором происходит конденсация раствора, немедленно попадающего на образец, находящийся в про- мьтной емкости на пористом фильтре. При достижении определенного уровня

55

5

При пщроксилировании поверхности силохрома раствором применение аппарата Сокслета невозможно, поскольку серная кислота нелетуча. Использование раствора серной кислоты на стадии гидроксилирования не приво- дит к достижению положительного эф фекта изобретения.

Пример. Зг силохрома обрабатывают в аппарате Сокслета хлороформом в течение 5 ч. После просушки образец обрабатывают в аппарате Сок- слета раствором НС1 в течение 2 ч при 100°С. Концентрация ОН-групп на поверхности составляет 0,7 мг/г,

Синтез титаноксидного слоя и ад сорбцию с -химотрипсина проводят по примеру 1. Концентрация белка на поверхности 29 мг/г, /5 0,39.

Примере. Зг силохрома обрабатывают хлороформом в аппарате Сок- слета в течение 5 ч 15%-ным раствором НС1, промывают, сушат при 200°С и 5 проводят модификацию поверхности

TiCl4, водой и раствором о -химотрип- сина по примеру 1. Концентрация ОН- групп на поверхности 1,1 ммоль/г, гетерогенный катализатор содержит

35

зо 45

зо 45

40

о Фермента 45,8 мг/г, уЗ 0,63. Пример9. Зг силохрома обра- батьшают хлороформом в аппарате Сок- слета в течение 5ч. После просушки образец помещают в раствор соляной кислоты на 4 ч при 70°С в водяной бане. Образец промывают водой и сушат при 200 С. Концентрация ОН- групп на поверхности 0,7 ммоль/г. После этого проводят синтез титаноксидного слоя и адсорбцию о -химотрип- сина по примеру 1. Концентрация фермента на поверхности составляет 28,8 мг/г, /3 0,39. Проведение стадии гидроксилирования целесообразно 5 , лишь в этом случае можно достигнуть положительного эффекта i.- изобретения,

Аппарат Сокслета позволяет проводить интенсивную обработку дисперсно/

g го образца, имеющего большую удельную поверхность, потоком свежепере- гйанного раствора.

Испарительная колба, содержащая раствор НС1, соединяется с холодильником, в котором происходит конденсация раствора, немедленно попадающего на образец, находящийся в про- мьтной емкости на пористом фильтре. При достижении определенного уровня

5

5

в емкости весь раствор вновь стекает в испарительную колбу.

Гидроксилирование образца в аппарате Сокслета идет в динамическом режиме.

Пример 10, Способ получения и мoбилизoвaннoгo протеолитического фермента отличается от способа по примеру 1 тем, что на стадии гидрок- сипирования поверхности используют 10%-ньй раствор соляной кислоты. В этом случае концентрация ОН-групп на поверхности составляет 0,8 ммоль/г, а концентрация адсорбированного о -химотрипсина на поверхности 32,6 мг /г носителя,

П р и м е р 11, Способ получения иммобилизованного протеолитического фермента отличается от способа по примеру 1 тем, что на стадии гидрок- силирования поверхности используют 20%-ный раствор соляной кислоты. В этом случае концентрация ОН-групп на поверхности 1,1 ммоль/г, а концентра ция адсорбированного о( -химотрипсина 45,7 мг/г носителя.

1626

Таким образомj использование изобретения позволяет значительно увели- .чить содержание иммобилизованного с/-химотрипсина в расчете на 1 г носителя - от 24 до 32-46 мг/г при высокой степени связывания (0,63 против 0,32) и при сохранении высокой удельной активности в расчете на 1 г носителя (около 75%).

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованного о(-химотрипсина, включающий обработку силохрома четьфеххлористым титаном и водой, адсорбцию фермента на модифицированном силохроме и промывку целевого продукта буферным раствором, отличающийся тем, что, с целью повышения содержания иммобилизованного о -химотрипсина в расчете на 1 г носителя, перед обработкой четьфеххлористым титаном силохром гид- роксилируют 10-15%-ным раствором соляной кислоты до достижения содержания гидроксильных групп 0,8-1,1 ммоль на 1 г носителя.