Способ иммобилизации протеолитических ферментов Советский патент 1976 года по МПК C07G7/02 

Изобретение относится к области производства ферментов и может быть использовано в пищевой, медицинской и микробиологической промышленности.

В настоящее время используются способы иммобилизации протеолитических ферментов на носителях органического и неорганического происхождения, таких, как производные целлюлозы, полиакриламида, декстраиов и других, а также бентонит, волластонит, силикагель, окиси алюминия и никеля, гидрокисапатит и пористые стек.ла, при этом неорганические носители более устойчивы к действию микроорганизмов, щелочей, кислот, температуры, не набухают и не изменяют своего объема в зависимости от рН среды и ионной силы растворов.

Известен способ иммобилизации протеолитических ферментов путем смещивания при кислом значении рН фермента, активатора и кремнеземсодержащего носителя, предварительно обработанного производным аминоалкилсилана, с последующим отделением и промывкой иммобилизованного фермента.

С целью улучшения качества ферментов по предлагаемому способу в качестве кремнеземсодержащего носителя используют силохром, а смещивание ведут при рН 4,5-5,5 и порционном добавлении активатора.

Способ осуществляют следующим образом.

Протеолитический фермент, например пепсин, вводят в контакт с водорастворимым активатором карбоксильных групп фермента - карбодиимидом и предварительно обработанным производным аминоалкилсилана кремнеземсодержащим носителем - силохромом.

Смешивание ведут в дистиллированной воде при рН 4,5-5,5 и порционном добавлении активатора. После окончания реакции водный раствор удаляют декантацией, а иммобилизованный фермент промывают последовательно растворами соляной кислоты, хлористого натрия и ацетатного буфера при рП 5,0 для снятия с носителя адсорбированного

за счет полного обмена фермента.

Пример. 50 мг пепсина, 22 мг водорастворимого п-толуолсульфоната - 1 - циклогексил - 3 - (2 - морфоминоэтил)-карбодиимида и 0,5 г .предварительно обработанного производным аминоалкилсилана силохрома смешивают в дистиллированной воде в теченне одного часа при 20°С, поддерживая рН смеси 4,5-5,5.

Затем к смеси вторично добавляют 22 мг

карбодиимида и продолжают перемешивание в течение двух часов при 20°С и рП 4,5-5,5.

Далее водный раствор удаляют декантацней, а иммобилизованный пепсин промывают последовательно растворамн 0,01 М НС1

1,0 М NaCl и 0,1 М ацетатного буфера при

3

рН 5,0 для снятия с носителя адсорбированного за счет нолного обмена фермента.

Количество ковалентно присоединенного к носителю фермента определяют путем гидролиза иммобилизованного фермента в присутствии 5,7 М НС1 при 105°С в течение 24 ч в вакумме, при этом установлено, что к 1 г силохрома .ковалентно присоединяется 40- 50 мг фермента. Активность иммобилизованного пепсина определяют по высокомолекулярному субстрату гемоглобина.

Установлено, что активность препарата, полученного по предложенному способу, при хранении его во влажном состоянии при рН 5,0 не меняется в течение нескольких месяцев, а иммобилизованный фермент практически

полностью сохраняет активность

исходного нативного пепсина.

Формула изобретения

Способ иммобилизации протеолитических ферментов путем смешивания при кислом значении рН фермента, активатора и кремнеземсодержащего носителя, предварительно обработанного производным аминоалкилсилана, с последующим отделением и промывкой иммобилизованного фермента, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества ферментов, в качестве кремнеземсодержащего носителя используют силохром, а смешивание ведут при рН 4,5-5,5 и порционном добавлении активатора.