Способ получения иммобилизован-НОй -АМилАзы Советский патент 1981 года по МПК C07G7/02 

ляют при 3-5С в течение 30-40 мин с последующимП)oкaливaниe fпри

535- в течение часа и CBHSbtBaHHCNi фермента при в течение 19-20 ч, а связывание фермента с матриней, актив 11)ованной Т1)ихлоридом титапа, осуществляют в течение 2 час.

Активацию матрицы трихлоридом тптана обычно осуществляют при 44-ббС в течение суток.

Описываемый способ позволяет получпть иммобилизованную а-амилазу с высокой активностью до 480 ед/г носителя. Иммобилизоваииая данным способом ОС-амилаза обладает также высокой стабильностью.

Хранение ферментного препарата при рН 4.7 и 4°С в течение года, а также пятидесятикратпое повторение сиецифнческой реакцин на 1,3 и 10%-ном )астворимом крахмале не меняет активности иммобилизован Hoio фермента.

Это обуславливается применение.м в качестве матрипы активированиых солями титана неорганических Si-содержащих мате)иалов (еилохрома и силикаге.ш), обладающих высокой удел1 иой иоверхностыо, что обеспечивает высокую активность полученного иммобилизованного фермента. Высокая микробиальная стойкость и механическая п)очность силохромов и силикагеле обеспечивает высоку о стабильность иммобилизованных даппым способом Gc-амилаз.

Так ь;ак спязываиие фермента с гюверх()ст1,ю активированпой ео.ьчми титана матрицы проводят в присутствии ацетата кальння, исключается ионный обмен между сс-амилазой, которая соде)жнт в своей молекуле ион Са, и поверхиостны.ми ионами РГ снлохро.мов и снликагелей. Г1|)иеутетв«е иоиа в молекуле а-амилазы . обеспечивает ее ферментпую активность, а добавление ацетата во время иммобилизации а-амилазы позволяет сохранить высокую активность препаратов. Концентрация ацетата кальн,11я 0,05 М является оптимальной, так как дальнейщее повышение концентрации не способствует повышению активности иммобилизованного фермента. Устаиовление рН среды в пределах 4,5-4,7 также способствует цовышению активности цолучеицых препаратов. В качестве а-амилаз для иммобилизации можно использовать а-амилазы грибного (Asp. oryzae) и бактериального (Бас. subtilis) происхождения. В качестве макропористых кремнеземов можно использовать силохромы и силикагели различных марок.

Пример 1. 1 г силикагеля МСА-750 заливают 5 мл 12,5% TiCls, растворенного в абсолютном этиловом спирте, интенсивно перемешивают и выдерживают 24 часа при 45°, затем реакционную смесь фильтруют, носитель промывают (тринады) 1 и. NaCl,

бидистиллированной водой (дважды) и 0,02 М ацетатным буфе1)ом (трижды) рИ 4,7.

Активированный носител1 инкубируют с 20 мл ферментного раствора, содержащего 80 мг фермента а-амилазы Asp. огу7.ас, в 0,02 М ацетатном буфере (рН 4,7) в присутствии 0,05 М ацетата кальция. У.меренно перемешивают при , 2 час.

Мммобнлизованный фермент отфильтровывают и промывают ацетатным буфером, рН 4,7 (трижды), затем 1 н. NaCi (трнжды) и бидистиллированной водой. Активность иммобилизованной ос-амилазы 445 ед/г

носителя. ,

Активность иммобилизованной а-амилазы определяют по методу Рухлядевой А. П. и Горячевой М. Г.

Приме) 2. 1 г еилохрома СХ-2,5 заливают 5 мл 12,5% TiCb,, растворенного в абсолютном этиловом спирте, интенсивно перемешивают и выдерживают 24 час при 4-5°С, затем реакционную емесь фильтруют, носитель промывают (трижды) 1 н.

NaCl, бидистиллированной водой (дважды) и 0,02 М ацетатным буфером (трижды) рИ 4,7.

Активированный носгггель инкуби)у1от с 20 мл ферментного раство|)а, содержащего 100 мг фермента а-амилазы Asp. oryzae в 0,02 М ацетатном буфере (рМ 4,7) в присутствии 0,05 ацетата кальцпя. Умсрецно пе1)емешивают при 20С, 2 ч. Иммобилнзованиый фермент отфи.тьтровываюг

и npOMbiBajOT ацетатным буфером, )Н 4,7 (трижды), затем 1 н. NaCl (трижды) и бидистиллированной водой. Активност препарата 347 е.д/г носите„тя.

Пример 3. 1 г еилохрома СХ-2,5 сусиендируют в 5 мл дистиллированной воды при 4С- и порциями по 0,1 мл через каждые 5 мин добавляют при интенсивном перемеи ивании 0,5 мл ТЮЦ. Через 40 мим носитель отделяют, промывают 0,0 н. HCI,

зате.м бидистиллированной во.дой до нейтральной реакции и прокаливаюг 1 час при 540°С.

Активированный носитель инкубируют с 20 мл ферментного раствора, ео.де))жащего 100 мг фермента а-амилазы Asp. oryzae, в 0,1 М ацетатном буфере (рП 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция. Умеренно перемешивают в течение 20 час. при4°С. фильтруют и промывают ацетатным буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 н. iSiaCl (трижды) и бидистиллированной водой. Активность препарата 353 е.д/г носителя.

Пример 4. г силохрома СХ-2,5 суспендируют в 5 мл дистиллированной воды при 4°С и иорциями по 0,1 мл через каждые 5 мип добавляют при интенсивиом перемешивании 0,5 .мл TiCi4. Через 40 мин носитель отделяют, промывают 0,01 н. HCI, затем бидистиллированной водой до нейтральной реакции и прокаливают 1 час при .

Активированный носитель инкубируют с 20 мл ферментного раствора, содержащего 100 мг фермента ос-амилазы Asp. oryzae, в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция. Умеренно перемешивают в течение 20 час при 4°С. Фильтруют и промывают ацетатным буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 н. NaCI (трижды) и бидистиллироваиной водой.

Активность препарата 337 е.а/г носителя.

Пример 5. 1 г силохрома С-80 заливают 5 .мл 12,5% TiCla, растворенного в абсолютио.м этиловом спирте, интенсивно перемешивают и выдерживают 24 час при 45, зате.м реакционную смесь фильтруют, носитель промывают (трижды) 1 н. NaC, бидистиллированной водой (дважды) и 0,02 М ацетатным буфером (трижды), рИ 4,7.

Активированный носитель инкубируют с 20 мл фер. ентного 1)аствора, содержащего 100 мг фермента а-амила.чы Вас. subtilis (Препарат Амилосубтилин Г-10Х, производимый в г. Вильиюсе) в 0,02 М ацетатном буфере (рП 4.7) в дчрисутствии 0,05 М ацетата кальция. Умеренно перемешивают при 2 ч, фильтруют и промывают ацетатным буферо.м, рН 4,7 (трижды), затем 1 н. NaCl (трижды) н бидистиллированной водой. Активность препа|)ата 340 ед/г носителя.

При.мер 6. 1 г силохрома С-120 заливают 5 мл 12,5% TiCls, растворенного в абсолютно.м этилово.м спирте, интенсивно перемешивают и выдерживают 24 час при 45С, затем фильтруют и-промывают (трижды) 1 н. NaCI, бидистиллированной водой (дважды) и 0,02 М ацетатным буфером (трижды), рП 4,7.

Активированный носитель инкубируют с 20 мл фер.ментного раствора, содержащего 80 .мг фермента а-амилазы Вас. subtil is, в 0,02 М ацетатном буфере (рП 4,7) в присутствии 0,05 М ацетата кальция. Умеренно перемешивают при 20°С 2 час, фильтруют, промывают ацетатным буфером рП 4,7 (трижды), затем 1 н. NaCI (трижды) и бидистиллированной водой. Активность препарата 359 ед/г носителя.

Пример 7. 1 г. силохрома СХ-2,5 .заливают 5 мл 12,5% Т1С1з, растворенного в абсолютном этиловом спирте, интенсивно пере.мешивают и выдерживают 24 час при 45°С, затем фильтруют и промывают (трижды) 1 н. NaCI, бидистиллированной во.:юй (дважды) и 0,02 М ацетатным буфером (трижды), рН 4,7.

Активированный носитель инкубируют с 20 мл ферментного раствора, содержащего 80 мг фермента а-амилазы Вас. subtilis, в 0,02 М ацетатном буфере (рН 4,7) в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

У1меренно перемешивают при 2 час. Фильтруют, промывают ацетатным буфером, рН 4,7 (трижды), затем 1 н. NaCI (трижды) и бидистиллированной водой.

Активность препарата 400 ед/г носителя.

Пример 8. 1 г снликагеля МСА-750 суспендируют в 5 мл дистиллированной воды при 4-С и порциями по 0,1 мл через каждые 5 мин добавляют при интепсивиом перемешивании 0,5 мл TiCl4. Через 40 мин носнтель отделяют, промывают 0,01 н. НС1, а затем дистиллировапной водой до нейтральной реакции и прокаливают 1 час при .

Активированный носитель инкубируют с 20 мл ферментного раствора, содержаniero 100 мг фермента а-амилазы Вас. subtilis. в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

Умеренно перемешивают в течение 20 час при 4°С. Фильтруют и промывают ацетатным буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 н. NaC (трижды) и бидистиллированной водой. Активность препарата 480 ед-г носитсля.

9. 1 г силикагеля МСА-1500 суспендируют в 5 .л дистиллированной воды при 4°С и порциями по 0.1 гл через каждые 5 мин добавляют при интенсивном перемешиванип 0,5 мл TiCU. Через iO мин носитель отделяют, промывают 0,01 н. ПС1, а затем бидпстнллированной водой .io нейтральной реакции и прокаливают 1 час при 540°С.

Активированный носител инкубируют с 20 мл ферментного раствора, содержаш,его 100 мг фермента а-амилазы Вас. subtilis. в 0,01 М ацетатном буфере рП 4,5 в присутствии 0,05 .М ацетата кальция.

Умеренно перемешивают в течение 20 час при 4°С, фильтруют н промывают ацетатным буферо.г, рН 4,5 (трижды), затем 1 н. NaCI (трижлы и би.чистиллировапной водой. Активность препарата 390 ед/г носителя.

Пример 10. 1 г силикагеля МСА-2500 суспендируют в 5 M.i листи,чли()овапной воды при 4 и порциями по 0,1 .л через каждые 5 мин добавляют при интенсивном перемещивании 0,5 мл . Через 10 мин носитель отделяют, промывают 0,01 н. НС1, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции и прокаливают 1 час при 540°С.

Активированный носитель инкубируют е 20 мл ферментного раствора, содержащего 100 мг фермента а-амилазы Вас. subtil is, в 0.1 М ацетатном буфере (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

У.черенно перемешивают в течение 20 час при 4°С, фильтруют и промывают ацетатным буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 п. NaCI (трижды) и бидистиллированной водой. Активность препарата 325 ед/г носителя.

Формула изобретения

1.Способ получения иммобилизованной ct-амилазы, включающий активацию нерастворимой матрицы хлоридом титаца и связывание фермента с активированной матрицей в среде ацетатного буфера, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и увеличения стабильности целевого цродукта, в качестве матрицы используют неорганический Si-содержащий материал, а связывание фермента осуществляют при рН реакционной среды 4,5-4,7 в присутствии 0,05 М ацетата кальция, причем активацию матрицы тетрахлоридом титана осуществляют при 3-5°С в течение 30-40 мин с последующим прокаливанием при 535-540°С в течение часа и связыванием фермента при 3-5°С в течение 19-20 час, связывание фермента с матрицей, активированной трихлоридом титана, осуществляют в течение 2 час.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неорганического Si-содержащего материала используют силохром или силикагель.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активацию матрицы трихлоридом титана осуществляют при 44-46°С в течение суток.

сточники информации, принятые во внимание пp экспертизе

1.S. А. Barker, Р. J. Soniers, R. Epton, «Recovery and re-use of water-insoluble amylase derivatives, Carbohyd. Res., 1970,

vol. 14, 3, 323.

2.S. A. Barker, P. J. Sorners, R. Epton, «Preparation and properties of a-aniylase chemically coupled to mycrocrystalllne cellulose, Carbohyd. Res., 1968, vol. 8, 491.

3. A. N. Emery, G. S. Hough, M. Novais, T. P. Lyons, «Some applications of solidphase en3ymes in biological engineering, «The Chemical Engineering, February, 1972, 258, 71-76 (прототип).