Способ количественного определения 5-гидроксиизофлавонов Советский патент 1990 года по МПК G01N30/94 

Изобретение относится к способу количественного определения 5-гидрок- сиизофлавонов, который может найти применение в анализе лекарственных и кормовых трав, галеновых препаратов.

Цель изобретения - повышение точности и чувствительности определения и его ускорение.

Пример 1. Определение содержания биоханина А в клевере ладино.

Фиксированное растительное сырье высушивают, измельчают, отбирают навески 10 г. Экстрагируют растительный материал 40-50 мл 90%-ного этанола на глицериновой или водяной бане (t 60-70°С) в колбе с обратным холодильником в течение 20-30 мин. Экстракт отделяют, а растительный материал снова заливают этанолом. Извлечение повторяют 4-5 раз, полученные экстракты объединяют, отфильтровывают и упаривают до водного остатка. Последний очищают в делительной воронке 5-6 порциями (по 50 мл) пет- ролейного эфира до тех пор, пока органическая фаза не станет бесцветной или слабо-желтой. Очищенный водный остаток упаривают на роторном вакуумном испарителе почти досуха, затем гидролизуют его при нагревании (100 С) в течение 3 ч с 5-10 мл 10%-ной серной кислоты.

Агликоны фенольных соединений извлекают из гидролизата 5-6 порциями этилацетата. Этилацетатные экстракты объединяют, упаривают досуха, растворяют сумму фенольных соединений в 5 мл метанола, Аликвоту 0,05 мл метанольного раствора наносят в виде полосы на хроматографическую пластину Силуфол, предварительно очищенную метанолом и активированную при нагревании в течение 30 мин при 120 С. Справа и слева от полосы фенольных соединений наносят пятна меток-свидетелей (биоханина А), Разделение проводят в камерах с насыщенной атмосферой в системе растворителей хлороформ + метанол ( 95-5-0,5).

По окончании разделения пластинку, сушат на воздухе 5-10 мин, затем опрыскивают 40%-ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, Полоса, содержащая биоханин А, приобретает -в УФ-свете желто-зеленую флуоресценцию, в видимом свете, если изо- флавона много, - светло-желтую окраску.

Флуоресцирующую в УФ-свете полосу очерчивают, соскребают силикагель с анализируемым веществом с хроматогра- фической пластинки и заливают его 0,1 мм раствора эфирата BF и 8 мл концентрированной уксусной кислоты, Смесь периодически встряхивают в течение 25 мин, отфильтровывают от адсорбента и флуориметрируют ( 6огБ - 254 им, Ъ „реп 580 нм) .

Параллельно проводят аналогичные процедуры для получения стандартного и фонового растворов. Содержание 5- гидроксиизофлавона определяют по формуле

YtМхСо Ф х Фср х -ф 1-ф--.

g

0

5

0

5

0

О где Y - объем метанола для растворения суммы фенольных соединений , мм; М - молекулярная масса изофлавонов, г/моль;

5 С0 концентрация стандартного раствора, моль/л;

g - навеска растительного материала, г;

Фу - флуоресценция исследуемого 0 раствора;

Фс - флуоресценция стандартного

раствора;

Фф - флуоресценция фонового раствора;

5 X - содержание 5-гидрооксиизофл а- вона в растительном материале, мг/г.

Содержание биоханина А в клевере ладино составляет, мг/г: по известному способу - в листьях 1,360, в стеблях 1,331; по предлагаемому способу - в листьях 0,310, в стеблях 0,970.

Пример 2. Определение гени- стеина и софорикозида в сумме фенольных соединений из Софоры японской. Сравнение точности предлагаемого способа и известного.

10 навесок, содержащих 0,7-0,9 г суммы фенольных соединений, и 10 таких же навесок с добавлением гени- стеина в количестве 0,5 кг/г и софорикозида 1 мг/г растворяют в 10 мл метанола. 0,1 мл раствора наносят на хроматографическую пластинку вместе с метчиками 5-гидроксиизофлавоног;. Разделение проводят в системе растворителей хлороформ + метанол 75-25, Rr генистеина 0,69iO,02, софорикозида 0,32j;0,03. По окончании разделения опрыскивают пластинку раствором эфирата BF, под УФ-светом очерчивают флуоресцирующие зоны и соскребают их с подложки. Элюирование проводят как в примере 1. Флуориметрируют с использованием стандартного и фонового 5 растворов (табл. 1 и 3).Параллельно проводят определение по известному способу с использованием спектрофото- метрии (табл, 2 и 4).

При определении генистеина на хроматографической пластинке в зоне Rr 0,60-0,75 мало мешающих феноль- ных соединений. Однако, вследствие невозможности полного удаления 5-гид- роксиизофлавона, выход его в известном способе на 15,9% ниже, чем в предлагаемом, точность предлагаемого способа в 4,3 раза выше.

При анализе софорикозида наблюдается большое количество мешающих фе- нольных соединений, что приводит в случае известного способа к завышению результатов (10,3%). Точность предлагаемого способа в 6,4 раза выше, чем известного. Низкий выход внутреннего стандарта в известном способе объясняется одновременным влиянием двух факторов - большим количеством примесей и неполным удалением с пластинки анализируемого компонента.

П р и -м е р 3. Приготовление стандартного и внутреннего растворов сравнения.

0,1-0,2 мл раствора известной концентрации наносят на пластинку и подвергают хроматографическому разделет нию как в примерах 1 и 2. Элюирование и флуориметрию проводят так же, как для анализируемых растворов. Фоновый раствор приготавливают по указанной методике из чистого силикагеля, удаляемого с пластинки, с площади, примерно равной площади полос анализируемых на хроматограммах 5-гидрокси- изофлавонов. .Использование фоновых растворов необходимо на однолучевых флуориметрах. В двулучевых приборах фоновые растворы использовать не нужно: флуоресценция фона учитывается автоматически.

Пример 4. Выбор реактива для идентификации 5-гидроксиизофлаво- нов на хроматографических пластинках Силуфол.

Для определения предела обнаружения проявляющих реактивов растворы генистеина, наиболее часто встречающегося представителя 5-гидроксиизо- флавонов, наносят на хроматографи- ческие пластинки в виде полос, содержащих -195, 100, 50, 40, 20, 10, 8, 5, 3 мкг.

Результаты определений представле.- ны в табл. 5.

Из табл. 5 видно, что эфират BF-j является наиболее чувствительным реактивом для идентификации 5-оксиизо768596

флаконов, в частности его открываемый минимум в 4 раза ниже, чем у pfc- актива, используемого в известном способе. В случае идентификации гли- козидов, например софорнкозида, наблюдается дополнительное увеличение флуоресценции, вероятно, за счет реакции между эфиратом ВГ и гликоэидJQ ной частью молекул определяемых веществ.

Пример 5. Исгользование эфи- рата BFj для количественного анализа 5-гидроксиизофлавонов.

15 .,5.1. Зависимость интенсивности

флуоресценции от количества добавленного 40%-ного раствора эфирата три

фторида бора в диэтиловом эфире.

0,2 мл раствора генистеина (1 г/л) в метаноле приливают к 8 мл концентрированной уксусной кислоты (концентрация генистеина в полученной пробе 24,4 мкг/мл). Затем к полученным таким образом пробам, добавляют различные объемы раствора эфирата BF. Такие же количества реагента приливают к 8 мл уксусной кислоты, несодержащей изофлавона. Этот раствор используют в качестве фонового. На основе

проведенных исследований установлено, что оптимальное количество эфирата BF5 0,05 - 0,3 мл на 8 мл уксусной кислоты (0,06 - 0,38 мл на 10 мл кислоты) .

Данные приведены в табл. 6.

5.2.Устойчивость флуоресцирукще- io комплекса во времени.

Готовят флуоресцирующий раствор, состоящий из 8 мл концентрированной

уксусной кислоты, 0,} мл раствора эфирата BF и 0,2 мл раствора генистеина в уксусной кислоте, несодержащий эфирата BF. Стрелку флуориметра устанавливают на значение 100% и измеряют зависимость флуоресценции о г времени.

Из табл. 7 следует, что в течение 30-35 мин флуоресценция раствора не изменяется. За это время в процессе

анализа 5-гидроксиизофлавоны элюиру- ют с адсорбента, фильтруют элюат и измеряют его флуоресценцию.

5.3.Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации генистеина.

В раствор, содержащий 8 мл уксусной кислоты и 0,1 мл эфирата BFg, добавляют 0,2; 0,1; 0,05; 0,02; 0,005мл раствора генистеина в метаноле

( мг/л). Полученные данные (с учетом фона) показывают линейную зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации анализируемого вещества.

Пример 6. Определение условий элюирования флуоресцирующего комплекса 5-гидроксиизофлавона с адсорбента .

6.. Подбор элюента.

В качестве элюентов для извлечения анализируемого компонента из адсорбента - сшшкагеля испробованы органические растворители - метанол, этанол, хлороформ, диэтиловый эфир, бен- зол, этилацетат, гексан, диметилсуль- фоксид, а также смеси метанола с концентрированными соляной, фосфорной и уксусной кислотами. Установлено, что флуоресцирующее соединение 5-гидрок- сиизофлавонов с BF3 : не элюируется чистыми органическими растворителями, разрушается в смесях метанола с соляной кислотой; в смесях фосфорная кислота - метанол элюирование проте- кает медленно из-за большой вязкости t растворителя (система растворителей ЬЦР04 + СНЭОН 3+7 извлекает за 30 мин 15%, за 48 ч 49% анализируемо гцо вещества, система ЬЦРОФ + СН3ОН 5+5 - за 30 мин 41%, за 49 ч 78%), смесь метанола и уксусной кислоты (1:9), а также концентрированная уксусная кислота позволяют полностью элюировать анализируемое вещество (табл. 8).

Измерение степени извлечения флуоресцирующего комплекса 5-гидроксиизофлавона и BF3 производят следующим образом. 0,02 мл раствора генистеина (1 г/л) наносят на хроматографичес- кук) пластинку Силуфол, затем после высыхания опрыскивают ее раствором эфирата BF-, соскребают силикагель, адсорбировавший изофлавон и заливают его 0,1 мл раствора эфирата BF3,8 мл элюента. Через 30 мин раствор отфильтровывают от адсорбента и флуори- метрируют. Фоновый раствор готовят аналогично, заливая элюирующей смесью такое же количество чистого силикаге- ла, В качестве стандарта используют смесь 0,02 мл раствора генистеина (1 г/л), 8 мл соответствующего элюента и 0,1 мл раствора эфирата BFj. Флуоресценцию стандартного раствора измеряют по отношению к смеси 8 мл элюента и О,1 мл раствора эфирата BFj .

Добавление раствора эфирата BF- в элюент необходимо для обеспечения полного перехода 5-гидроксиизофлавона в флуоресцирующую форму (т.е.,для полного протекания реакции между изо флавоном и BF9).

6.2. Определение длительности элюирования 5-гидроксиизофлавонов концентрированной уксусной кислотой.

На хроматографическую пластинку наносят по 0,02 мл растворов генистеина и софорикозида. Проявление и удаление 5-гидроксиизофлавонов с адсорбента проводят как в примерах 1 и 2. Элюируют 8 мл концентрированной уксусной кислоты с добавлением 0,1 мл раствора эфирата ВГ3 . Время элюирования варьирует от 5 до 30 мин. Измеряют флуоресценцию как в примере 6.1

Зависимость полноты извлечения анализируемых веществ от времени элюирования приведена в табл. 9.

Таким образом, полное извлечение комплексов 5-гидроксиизофлавонов (как гликозидов, так и агликонов) протекает, за 25-30 мин. Использовать большее время элюирования нецелесообразно, так как после 35 мин флуоресценция элюата начинает уменьшаться. Элюирование известным способом позволяет извлечь за 30 минут 82,3%, за 10 ч 98,1%, за 24 ч 101% (за счет примесей) 5-гидроксиизофлавона агли- кона.

Пример 7. Продолжительность определения 5-гидроксиизофлавонов.

Данные по продолжительности аналитического определения 5-гидроксиизофлавонов известным и предлагаемым способами приведены в табл. 10.

При определении 5-гидроксиизофлавонов в фармацевтических препаратах, суммах фенольных соединений анализ предлагаемым способом проводят примерно в 9 раз быстрее, чем с использованием известного способа. Если изофлавоны анализируют непосредственно в растительном сырье, необходимо проводить процедуры экстракции и очистки. При этом общая продолжительность анализа предлагаемым способом в 2,3-3,4 раза меньше, чем известным

Предлагаемый способ имеет точност в средне-м .в 4-6 раз выше, предел обнаружения 5-гидроксиизофлапонов в 2- 3,5 раза ниже, чем известный способ. Время выполнения собственно анализа в предлагаемом способе в У раз (с использованием экстракции в 2,3-3,4 раза) меньше, чем в известном.

Формула изобретения

Способ количественного определения 5-гидроксиизофлавонов, включающий экстракцию и очистку фенольных соединений, их хроматографическое разделе- ние на закрепленном слое силикагеля, проявление 5-гидроксиизофлавонов, элюирование их.из силикагеля органическим растворителем, о -т л и ч а ю- I

щ и и с я тем, что, с целью повыше-., ния точности и чувствительности определения и его ускорения, проявление проводят 40%-ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, в качестве элюента используют концентрированную уксусную кислоту, содержащую 0,06-0,38 мл 40%-ного раствора эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире на 10 мл кислоты, и полученный элюат подвергают флуори- метрированию.

Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения 5-гидроксиизофлавонов, может быть использовано в анализе лекарственных и кормовых трав. Цель - повышение точности и чувствительности анализа при сокращении его длительности. Анализ пробы ведут экстракцией и очисткой фенольных соединений, их хроматографическим разделением на закрепленном слое силикагеля и проявлением 5-гидроксиизофлавонов с помощью 40%-ного раствора эфирата BF 3. Затем проводят элюирование продукта концентрированной CH 3C(O)OH, содержащей 0,06 - 0,38 мл 40%-ного раствора BF 3 в диэтиловом эфире на 10 мл CH 3C(O)OH, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. Эти условия повышают точность анализа в 4 - 6 раз, чувствительность в 2 - 3,5 раза при меньшем в 2,3 - 3,4 раза времени определения, чем в известном случае. 10 табл.

Примечание. Дисперсия 0,069, коэффициент вариации А,40.

Примеч ание. Дисперсия 0,758, коэффициент вариации 18,02.

Таблица 1

Таблица 2.

Примечание. Дисперсия 74,21, коэффициент вариации 11,5%. Оптическую плот- ногть определяют разбавлением фотометрируемого раствора в 10 раз.

сутствии фенольных соединений клевера ладино В видимом свете светло-ко- 50 ричневая окраска

В видимом свете светло-ко- 20 ричневая окраска

Таблица 3

Таблица 5

,Н

Опрыскивание 0,1%- ным ZrOCl2 в метаноле

Опрыскивание 0,1%- ным ZrOCL2 в метаноле

Опрыскивание 0,5%-ным А1СЦ в метаноле

Опрыскивание раствором диазосульфанило- вой кислоты в 15%- ном

Опрыскивание смесью хлорсульфоновая кислота + хлороформ 4+1

0,01 М йода в 0,025 М 1 растворе KJ в воде

Опрыскивание 1%-ным дифенилборным эфиром аминоэтанола и 5%-ным полиэтиленгликолем 400 в метаноле

Опрыскивание 40%-ным раствором эфирата BF,, в диэтиловом

В УФ-свете желто-зеленая 40-50 3,6-4,5 флуоресценция

В видимом свете светло-жел- 50 4,5 тая окраска

В УФ-свете (253 им) желтая 50-100 4,5-9,0 флуоресценция

В видимом свете красно-ко- 20 1,8 рнчневая окраска

В видимом свете желтая ок- 20 1,8 раска

В видимом свете коричневая 20-40 1,8-3,6

или желтовато-коричневая

окраска

В УФ-свете (360 нм) желтая 10-20 0,9-1,8 флуоресценция

В видимом свете светло-жел- 20-40 1,8-3,6 тая окраска

Количество, мл, раствора эфирара ВГЭ на 8 мл уксусной кислоты

То же, на 10 мл уксусной кислоты

Интенсивность флуоресценции:

в абс. единицах

в %

0,000,030,050,200,300,400,501,00

0,000,040,060,250,380,500,631,25

315353535343429

8,642,8100,0100,0100,097,197,182,4

Таблица 6

с

Фильтр - синяя или желтая лента

В известном способе спектрофотометр СФ-16, в предлагаемом способе флуориметр ЭФ-ЗМА

Собственно анализ

Анализ + экстракция и очистка фенольных соединений 1230

При определении глнкоэидов стадия тидролиэа отсутствует.

Таблица 8

Таблица 10

5 25

10 5

785

90

355-535