Способ определения миоглобина Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 

Ичпбрь тение относится к области пссже. К плния биолп| 1Г4ес:ких веществ, п имоиио миоглобина, и может быть использопяно в различных биохимических исследованиях, в частности для ранней диагностики ряда заболеваний и па- толог ических состояний, сопровождающихся гипермиоглоРинемией и миогло- бинурией.

Целью изобретения является повышение точности способа за счет повышения чувствительности метода определения миоглобина в реакции гемагглю- тичацми.

Процесс вь1деления и очистки миоглобина, получение гипериммунных сывороток против миоглобина осуществля- :от в соответствии с известными методами.

Специфические иммуноглобулины класса G получают из гипериммунных сывороток от многократного и длительно иммунизированных животных. Антитела выделяют колоночной аффинной хроматсг графией на иммуносорбенте С иммобили- зирован1 ьгм миоглобином. Приготовление иммуносорбента осуществляют известным методом с использованием BrCN активированной сефарозы «iB в качестве матри цы.

Имьгуиную сьшоротку против миоглобина циркулируют через иммуносорбент со скоростью 5 мл/ч в течение 15-18 ч при комнатной температуре. После отмывки с иммуносорбеита неспецифических связанных белков осуществляют элюцию антител 0,2 м глицин-НС1-буфе- ром, рИ 2,2. Скорость пропускания буфера 5 мл/ч. Фракции, содержащие специф1гческие антитела, объединяют, подщелачивают до рИ 8,0 и диализуют против 500-крлтного объема О,1 М карбонатного буфера, рП 9,6.

Концентрацию специфических антител против миоглобина определяют из спек- Грофотометрических данных при длине, волны 280 им, используя молекулярный коэффициент экстинк1;ии 1,98х х10 М -см . Выделенные антитела хранят при -20 С,

Формалинизация куфиных эритроцитов.

Собирают кропь от 200-300 бройлеров во флаконы с раствором Олсвера в соотношении 1:1. Флаконы помещают в холодильник на 3-4 дня. Плазму удаг ляют, эритроциты отминают центрифуги- Г Ованием ы 20-кратном объеме

0

5

0

5о

t Q

5

0

5

физиологическо о рлстпора. Готовят 50%-iiyio взвесь клеток в физиологическом растворе.

К 50%-ной взпеси клеток прибавляют 5-крат 11,1Й объем физиологического раствора, содержащего 7, формальдегида и 0,5% глюкозы, рН 7,0. После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре смесь переносят в холодильник (4f2 c), выдерживают в течение недели с ежедневным ресуспендированием эритро1и1тов. Через неделю надосадочную жидкость сливают, а осадок зритроцитон взвешивают в физиологическом растворе, содержащем А% формальдегида, рН 7,0. Хранят формалинизированные эритроциты в виде 50% взвеси при 4t2°C.

Отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов устанавливают следующим образом.

В несколько лунок полистироловой пластины вносят по 50 мкл физиологического раствора и по 25 мкл 2%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов. Если через 20-30 мин эритроциты осядут в виде четкой точки, то они могут быть использованы для дальней- ией работы. Сенсибилизация формали- зированных эритроцитов иммуноглобулинами класса против миоглобина.

Сенсибилизацию формалинизированных куриных эритроцитов иммуноглобулинами против миоглобина проводят с помощью хлорида хрома и танина. В специальных экспериментах была подобрана оптимальная концентрация специфических иммуноглобулинов класса G на 1 эритроцитарную клетку, обеспечивающая высокую чувствительность диагностического nptji рата. Оптимальными установлены соотношения антител к эритроцитам (1,6-3,2)10. Повышение значений коэффициента приводило к спонтанной агглютинации эритроцитов и снижению воспроизводимости метода приготовления препарат т, а уменьшение - к падению чувствительности диагностикума.

Пример 1. Приготовление диагностикума при введении в реакцио1 ;- ную среду 1,6-10 молекул иммуноглобулинов класса G на 1 эритроцитарную клетку.

объему раствора антител тив миоглобина в концентрации 400 мкг/мл добавляют 8 объемов ли- стиллированнон воды, 1 объем 50%-Hoii

,, Сюрпой кисло- сяхярозы, 1% бы

пзррси фп)П(л пи-щроплпмых ку|)пмьг три

троцитов и 1 оГч-см 0,3д-мого ряотворя х;горндя хромп. Сипсь инкуГчфуь: т

при костояимом гк. Г/емегаииании 1520 NtHH при комнатном TPNmeparypr по

слр мего эритроциты трижды oт fыpaкrr

центрифугированием при ЬОО

в течение 10 MHI., 0 :адок эритроцит он

сусгюпдируют в растворе защитной opt

ды, состоящей ил 1

ты, 0,5% буры, 10%

чьего cbiBopoToMHOfo а.чьбумина до

2,5%-ной концен-рлции и лиоФилизируют .

Пример 2, Г1риготг1нлеиме дмагностикума при вяедркии в ррпкпионную среду 3,2-10 молекул иммуноглобулинов класса ( кл 1 притроцитар(ую клетку.

К 1 объему рястпора штмгел г рп- тив муюг. шбииа }) конпентрлции 800 мк/ добавляют 8 объемов диcтил. rpoвяllнoй воды, 1 обьем 50%-нон взвеси формм- линизированньгх куримых эритро1Ц1тов и 1 объем 0,3%-ного раствора 5 лорид хрома. Последумци операщш проводят по примеру 1.

Специфическую активность эр тро- цитарного диагностикума определяют в реакции пассив1;рй гсмзгглютииации (РПГЛ). В 16 луяок пласт шы с V-об- разным профилем лунок вносят по 30 мк физиологического раствора. В первую лунку вносят 50 мкл раствора ;Iloглo- бина с концеHTpaiuieft 1 мкг/мл и проводят его последовательные двукратные разведения путем переноса 50 мкл из лунки Р лунку. В две контрольные лунки миоглоПтп не нносят. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл 1%-ной взвеси зритрицитов с иммобилизиро- ванными на ниХ антителами к миогло- бнну. Пластину встрихппают и остав

ЧРИ OTHOII i I 1 Лт/ )пит ,ь-10 ai - ; л ггинация наГичс лае ст в iiepm.ix 9 лунклх пластины, что соответствует мииим;,ги,Н1ТЙ выявляемо/ клплентрации №1оглобима, рампой /. мг/мл. При использовании диaгн.l(, приготовленного при соотношении Ат/Эрит 3,3-10 агглютинация наблтодается в

лункях, что соответствует минимальной выявляемой концентрации мио- глобина, равной 0,5 мг/мл.

Предложенный диагностикум обеспечивает в 10 раз повышение чувстви- тельности опреде;1ения миоглобнна, уменьшает в 8-9 раз время выполнения анализа и существенно облегчает ход выполнения анализа за счет со- кра цения этапов опргдслекия йяогло- , бина, что важно для осуществления кспресс.-диагностики инфаркта миокарда у пациентов в успоииях скорой помощи и в учреждениях практического здравоохранения.

Использование предлагаемого диаг ностикума обеспечивает повышение чуй-- ствительности анализа в 10 раз по сравнению с базогым объектом, уменьшение в 8--9 раз времени г.г,гполнсни« анализа ii существенно оГч;егчает ход вь полнения анализа, что ва;кчс д-тя осуществления экспресс-диагностики инфаркта миокарда и пациентов в условиях скорой ПОМОП1И и в учре; дениях практического здравоохрячения.

Формула и 3 о О р е т е и 1Т я

Споссб опиеделения ми глобина путем использования сс;нсп1 ч(лиаиров.1Н- ньпс формалинизированн.гх :)итроцитов Б реакции гемагглюпчгнацп;;, отличающийся том, чтп, с целью повышения точности опредгл ш я за

Изобретение касается биологии, исследования биологических веществ, а именно миоглобина, предназначенного для ранней диагностики ряда заболеваний и патологических состояинй, сопровождающихся гипермиоглобинемией и миоглобинурией. Цель изобретения - повышение точности способа за счет повышения чувствительности метода определения миоглобина в реакции гемагглютинации. Для зтого получают специфические иммуноглобулины класса G.Антитела вьщеляют колоночной аффинной хроматографией на иммуносорбенте с иммобилизированным миоглобином. Импульсную сыворотку против миоглобина циркулируют через иммуносорбент со скоростью 5 мл/г 13-18 ч. После отмывки с иммуносорбента неспецифически связанных белков осуществляют элюцию антител 0,2 м глицин - НС1 - буфером, рН 2,2. Фракции со специфическими антителами объединяют, подщелачивают до рН 8,0 и диалиэуют против 500-кратного объема 0,01 М карбонатного буфера, рН 9,6. Концентрацию специфических антител против миоглобина определяют из спектрофотометри- ческих данных при Л 280 им, используя коэффициент экстинкции 1,98x10 М -см . Ставят реакцию гемагглютинации: сенсибилизированнь е амнУноглобулинами формалинизированные эритроциты кур против миоглобина. Реакцию проводят с помощью хлорида хрома и танина. Оптимальными установлены соотношения антител к эритроцитам

ляктг при коинатной тег пературе. Через 5 повышения чувстпитс--ьпости реак- 20-30 мин пров,5дят учет ррзультатог ,ции гемагглютинации, пгио-ч-зугот эриВ контрольн,;:-. лунках эритроцитытроциты кур, сенсиС млтип анныс имдолжны распределяться в ни;;е четкой точки на дне , что сгч цетпльству- ет об отсутгтшм самопроп-шол нойCQ

агглютинации рптропд тин.

гyнoглoбyлинaми против мис т-тобина npif соотногаении (1, 6-3, 2) 1 0 молекул антитс-л G нл пдич- :п1итроци- тапную клетку.

троциты кур, сенсиС млтип анныс им гyнoглoбyлинaми против мис т-тобина npif соотногаении (1, 6-3, 2) 1 0 молекул антитс-л G нл пдич- :п1итроци- тапную клетку.