СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛОБИАЗ Советский патент 1995 года по МПК C12N9/42 C12N9/42 C12R1/66 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения целлобиаз (β -глюкозидаз) из грибов.

Целлобиазы (β -глюкозидазы) как компоненты целлюлолитического комплекса играют важную роль в процессе биоконверсии растительных отходов, а именно участвуют в процессе превращения целлюлозы в глюкозу. В связи с этим разработка простых способов получения целлобиаз имеет практическое значение.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса.

Способ заключается в следующем.

Ферменты выделяют из фильтрата культуральной жидкости грибов-продуцентов Aspergillus terreus, Aspergillus foetidus, Aspergillus awamori и Aspergillus niger или из промышленного препарата пектофоетидина (Aspergillus foetidus). Аналогичным образом можно выделять целлобиазы других грибов.

Особенностью предлагаемого способа является то, что в качестве сорбента для хроматографии целлобиаз используется сорбент не на полисахаридной основе, а ионообменная смола типа КМТ или Биокарб или КРК или КМ 2n, позволяющая увеличить скорость сорбции с 1,5-5,1 мк/см²˙ч до 50-100 мл/см²˙ ч, причем очистка проводится в одну стадию.

Ферменты сорбируют на катионите при рН 4,0-4,3 при рН > 4,3 происходит неполная сорбция целлобиаз, нижний предел рН 4,0 ограничен свойствами сорбентов. Интервал рН элюцин указывает область получения целлобиаз с оптимальным соотношением выхода и степени очистки. Ниже рН 4,8 ферменты не десорбируются, выше рН 5,0 - целлобиазы десорбируются вместе с примесными белками.

За единицу активности в работе принимали количество фермента, которое расщепляет 1 мкмоль целлобиазы за 1 мин при 40^оС.

П р и м е р 1. Фильтр культуральной жидкости гриба Aspergillus terreus подкисляют уксусной кислотой до рН 4,3 и разводят водой до концентрации 0,3 М (контроль по электропроводности, кондуктометр калибруют по ацетату натрия). Целлобиазу из фильтрата культуральной жидкости сорбируют со скоростью 50 мл/см²˙ч на колонке с карбоксильным катионитом КРК при рН 4,3 (1 л фильтрата культуральной жидкости на 100 г сорбента). Промывают колонку 0,1 М ацетатным буфером, рН 4,3. Элюируют целлобиазу 0,2 М ацетатным буфером рН 4,8. Элюат концентрируют и диализуют ультрафильтрацией (мембрана ХМ-50). Получают целлобиазу с выходом 200% (в процессе очистки удаляется ингибитор фермента). Из 1 л фильтрата получают 0,1 мг фермента со степенью очистки 600.

П р и м е р 2. Целлобиазу получают, как описано в примере 1, на карбоксильном катионите КМ 2n, но перед сорбцией фильтрат культуральной жидкости разводят водой до 0,05 М. Выход фермента составляет 150%.

П р и м е р 3. Целлобиазу получают, как описано в примере 1, на катионите КМТ. Сорбируют целлобиазу на 1 л фильтрата культуральной жидкости на 10 г сорбента. Выход фермента составляет 200%.

П р и м е р 4. Целлобиазу получают, как описано в примере 3, на катионите Биокарб Д с выходом 200%.

П р и м е р 5. Целлобиазы из фильтрата культуральной жидкости разведенного водой до 0,2 М, как описано в примере 1, гриба Aspergillus awamori сорбируют со скоростью 80 мл/см²˙ч на колонке с карбоксильным катионитом КРК при рН 4,0 (1 л фильтрата культуральной жидкости на 100 г сорбента). Промывают 0,1 М ацетатным буфером, рН 4,3, затем дистиллированной водой. После промывки водой можно нанести дополнительную порцию фильтрата культуральной жидкости и снова промыть сорбент, как указано выше. Элюируют целлобиазы 0,2 М ацетатным буфером, рН 4,8, при этом происходит разделение 2-х целлобиаз, которые затем концентрируют и диализуют ультрафильтрацией (мембрана ХМ-50). Получают 2 целлобиазы с суммарным выходом 70%.

П р и м е р 6. Целлобиазы получают, как описано в примере 5, на карбоксильном катионите КМТ, но проводят сорбцию целлобиаз из 1 л фильтрата культуральной жидкости на 10 г сорбента. Фильтрат культуральной жидкости разводят перед нанесением до 0,3 М, как описано в примере 1. Получают 2 целлобиазы с общим выходом 75%.

П р и м е р 7. Две целлобиазы получают, как описано в примере 6 на карбоксильном катионите Биокарб Д с общим выходом 70%.

П р и м е р 8. Целлобиазу из фильтрата культуральной жидкости (разведенного водой до 0,2 М), как описано в примере 1, гриба Aspergillus niger сорбируют со скоростью 100 мл/см²˙ ч на колонке с карбоксильным катионитом КРК при рН 4,0 (1 л фильтрата на 100 г сорбента). Промывают, как описано в примере 5. Элюируют целлобиазу 0,3 М ацетатным буфером рН 5,0, затем элюат концентрируют и диализуют ультрафильтрацией. Получают целлобиазу с выходом 100%, удельной активностью 124 ед/мг, степенью очистки 110-36 мг целлобиазы из 1 л фильтрата культуральной жидкости.

П р и м е р 9. Целлобиазу получают, как описано в примере 8, на карбоксильном катионите КМТ (1 л фильтрата культуральной жидкости на 10 г сорбента) с выходом 100%.

П р и м е р 10. Целлобиазу получают, как описано в примере 9, на катионите Бикарб с выходом 100% (1 л фильтрата культуральной жидкости на 10 г сорбента).

П р и м е р 11. Целлобиазу из промышленного препарата пектофоетидина (Aspergillus foctidus), растворенного в дистиллированной воде (1 г препарата в 200 мл воды), сорбируют на колонке с карбоксильным катионитом Биокарб Д (1 г препарата на 5 г сорбента) со скоростью 100 мл/см²˙ ч. Промывают 0,1 М ацетатным буфером, рН 4,3, затем водой. Элюируют целлобиазу 0,2 М ацетатным буфером, рН 4,8. Получают 6,6 мг фермента с удельной активностью 8,2 ед/мг и выходом 100%.

П р и м е р 12. Целлобиазу получают, как описано в примере 11, на катионите КРК, но сорбируют 1 г препарата на 50 г сорбента. Выход фермента составляет 100%.

П р и м е р 13. Целлобиазу получают, как описано в примере 11, на катионите КМТ. Выход фермента составляет 100%.

П р и м е р 14. Целлобиазу получают, как описано в примере 11, на катионите КМ 2n, но 1 г пектофоетидина растворяют в 2 л воды. Выход фермента составляет 100%.

Использование ионообменных смол позволяет провести весь процесс выделения в одну стадию, в 15-20 раз по сравнению с известным способом увеличить скорость протока через колонку, таким образом сокращая время очистки.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛОБИАЗ, предусматривающий хроматографию содержащего их раствора на карбоксильном катионите, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, хроматографию проводят на карбоксильных катионитах на неполисахаридной основе типа КМТ или биокарб или КРК или КМ 2 n в условиях ацетатного буфера при pH 4,0-4,3 со скоростью 50-100 мл/см² ч с последующей элюцией ферментов тем же буфером, pH 4,8-5,0.