Способ получения 9 @ -гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона Советский патент 1993 года по МПК C12P33/00 

i Изобретение относится к способу получения 9 а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дио- нг(Э-ОН-АД) из стеринов путем MV кробиологического превращения. 9-ОН- АД является ключевым продуктом для получения стероидных активных веществ. Из эт( го продукта могут быть получены высокоактивные стероиды прегнанового ряда, имеющие широкие области применения.

: Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Сущность изобретения.

В основу изобретения положена задача описания усовершенствованного микробиологического способа получения 9 а-гидро- ксиандрост-4-ен-3,17-диона(9-ОН-АД), который позволяет получить этот продукт при высокой производительности превращения стеринов и существенно более корот- .ких продолжительностях ферментации с хорошим выходом.

Согласно изобретению эта задача решается способом микробиологической трансформации штаммами рода Mycobacterium

00 CJ VI

О

VI со

vaccae так, что для трансформации данного стерина или смеси стеринов используются штамм М. vaccae ZIMET11052 или штамм М. vaccae ZIMET 11053. Используемые согласно изобретению штаммы депонированы в месте депонирования микроорганизмов ГДР, Центральном институте микробиологии и экспериментальной терапии Академии Наук ГДР, Бойтенбергштрассе 11, ГДР-Йена 6900. за вышеуказанными номе- рами регистрации.

Характеристика штаммов.

Штаммы Mycobacterlum vaccae ZIMET 11052 и Mycobacterium vaccae ZIMET 11053 были проселектированы в отделе микроби- ологии стероидов института ЦИМЭТ/Йена и депонированы в отделе депонирования штаммов института ЦИМЭТ.

Морфология.

После засева косяков (среда примера № 1) микроорганизмами штамма М. vaccae ZIMET 11052 или 11053 ичетырех-пятиднев- ного инкубирования при 28-37°С образуется плотный бактериальный газон от желтого до оранжево-желтого цвета. Окрашивание происходит особенно быстро и интенсивно под действием света, но имеет место также в полной темноте (скотохромогения). Масса бактерий штамма М. vaccae ZIMET 11052 имеет гладкую влажную и блестящую повер- хность. Поверхность массы бактерий штамма М. vaccae ZIMET 11053 имеет сухую крошащуюся структуру, На микроскопическом изображении клетки двух штаммов после поверхностного культивирования не проявляют заметных различий. Они имеют длину в 1-4 мкм и ширину в 0,5-0,8 мкм, иногда слегка изогнуты и имеют легкое утолщение концов. Можно наблюдать короткие цепочки и клеточные грозди. .

После выглаживания микроорганизмы обоих штаммов отличаются друг от друга морфологией колоний.

Мус. vaccae ZIMET 11052 (S-форма): колонии круглые, выпуклые, с гладким краем, с влажным блеском, желто-оранжевого цвета, диаметр около 2 мм.

Мус. vaccae ZIMET 11053 - (r-форма), колонии круглые с неравномерным краем, плоские крошащиеся, тупые, желтоватого до бежевого цвета, диаметр около 7 мм.

Находясь в жидкой культуре, штамм Мус. vaccae ZIMET 11053 обращает на себя внимание сильным агрегатообразованием.

Употребление углеводородов и сахарных спиртов микроорганизмом штамма Mycobacterlum vaccae ZIMET 11052 и Mycobacterlum. vaccae ZIMET 11053 приведено а табл. 1.

Амидазная активность штаммов Mycobacterium vaccae ZIMET 11052 и Mycobacterlum vaccae ZIMET 11053 приведена в табл. 2.

Для целей согласно способу по разным вариантам изобретения в аэробных и стерильных условиях культивирования ферментируют штамм М. vaccae ZIMET 11502 или штамм М. vaccae ZIMET 11053 в водной питательной среде, содержащей наряду со стерином источник углерода (как например, глицерин, глюкозу, сахарозу, крахмал или лактозу), источник азота (как, например, дрожжевой экстракт, мочевину или гидроли- зат казеина), а также минеральные соли. Для этой ферментации применяют такие стерины, как ситостерин, холестерин, кам- пестерин, стигмастерин или эргостерин или смеси этих стеринов. Стерин вносится в водную ферментационную среду либо как таковой, либо в виде препарата из стерина и поверхностно-активного вещества (ПАВ), причем рабочую концентрацию стерина подбирают в пределах 1,0 г/л до 50 г/л ферментационного раствора. Применяемые при необходимости препараты из стермна и ПАВ подготавливают, смешивая данный стерин способом мокрого помола, лиофили- зации или распылительной сушки с ПАВ называемых ниже групп А или В, причем долевая часть ПАВ в готовом препарате составляет 1,0-2,0 мае. %.

Под ПАВ групп А или В понимают блочные сополимеры полиэтиленоксид (ПЭО) по- липропиленоксид (ППО) с удельным весом 30-70% полипропиленгликоля или ПЭО/ППО-аддукты М,ы -тетрэ(оксипропил- пропион)-М--(2-оксипропил)-диэ- тилентриамина.

Ферментацию целесообразно провести на стадиях предварительного и основного культивирования, ее проводят при температурах 25-35°С в течение 48-96 ч. причем величину рН подбирают в пределах 6,0-9,0.

Далее при необходимости в ферментационную среду добавляют либо сначала, либо в течение культивирования сорбент типа органического полимера в рабочей концентрации 10-160 г/л.

В частности при вариантах способа с использованием сорбентов применяют органический полимер, возникший из этилви- нилового и дивинилового бензена, с полярными группами, вчастности, полярными группами на основе эфиров акриловой кислоты.

Ферментацию можно провести в круглых колбах и широкогорлых склянках различной вместимости, в стеклянных ферментаторах с мешалкой, а также в аппаратах из коррозиестойкой стали. По оконча- H||IH ферментации образовавшийся 9-ОН- АД получают по варианту способа без сорбента, собственно известным образом, экстрагированием органическими растворителями, предпочтительно бути л ацетатом, с последующей кристаллизацией.

При варианте способа с использованием сорбента очистку начинают с отделения ct рбента от культуральной жидкости, предпочтительно путем фильтрации, а 9-ОН-АД получают, наконец элюированием сорбента органическими растворителями, такими, как метанол, этанол или ацетон или же водными растворами таких средств, концентрированием элюата примерно до 10% ис ходного объема с повторной фильтрацией, а также перекристаллизацией.

В предпочтительном варианте способа, nj: и котором ферментировали клетки штамма ZIMET 11053 в среде с добавкой 140 г/л сорбента вышеуказанной характеристики в течение 96 часов при 28°С, в зависимости от nj: именяемого количества стерина в масштабе круглой колбы был получен выход 9- СЖ-АД в пределах 35-50 мае. % (аналитические значения), причем было уста -ювлено остаточное содержание стерина м« нее 5 вес. %. Как оказалось, в этих условиях способа используемый сорбент выше- укззанной характеристики оказывает не только благоприятное влияние в отношении оч летки получаемого 9-ОН-АД, более того, в результате достигается повышенное образование продукта, и тем самым, повышенное использование стерина. Обобщая, можно сказать, что преимущества способа заключаются в том, что продукт 9-ОН-АД может быть получен при небольшой продолжительности времени ферментации и с хорошим выходом при использовании штамма микроорганизма, классифицированного как непатогенного, и что при варианте способа с добавкой сорбента продукт 9-ОН-АД не только удаляется из культуральной жидкости, но дополнительно достигаются еще и более высокие выходы продукта (см. табл. 1).

Пример 1. Микроорганизмы Mvcobacterlum vaccae ZIMET 11053 культивируют в течение 7 дней при 28°С на агаро- воч косяке следующего состава: 20 г пн церина,, 5 г бакто-пептона, 5 г мясного экстракта, 15 г агар-агара, дистиллированной воды на 1000 мл. рН 7,0 (культура в пробирках).

; Смытыми клетками каждой пробирки засевают круглодонные колбы вместимостью 500 мл, содержащие по 50 мл питательной жидкости следующего состава: 10 г

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

глицерина, 10 г дрожжевого экстракта, 0,5 г КН2Р04 .1,5 г (NH-02BP04. 0,2 г MgSOo x х7Н20, 0,0.1 г FeS04 7Н20, 0,002 г ZnS04 x х7Н20, дистиллированной воды на 1000 мл, рН7,0.

Через 72 ч встряхивания на круговой качалке при 200 об/мин и 28°С используют по 5 мл этой предварительной культуры для засева ферментационной культуры.

Десять круглодонных колб вместимостью 500 мл загружают каждую 7 г сырого сорбента типа органического полимера (возникшего из этилвинилового и дивинило- вого бензена, с полярными группами на основе эфиров акриловой кислоты), 10 мл препарата из ситостерина и ПАВ (100 г си- тостерина, 10 г ПАВ группы В, дистиллированной воды на 1000 мл, мокрого помола) и 50 мл ферментационной среды. В качестве ферментационной среды используют раствор из 5 г глюкозы, 10 г дрожжевого экстракта, 1,3 г «2НР04 -ЗН20, 1,5 г (NH-OaHPO/i, 0.2 г MgS04 7Н20, 0,01 г FeS04 7Н20, 0,002 г 7Н20, дистиллированной воды на 1000 мл, рН 8,0.

Подготовленные таким образом колбы стерилизуют в течение 20 минут при 120°С и засевают после охлаждения, после этого осуществляют 96-часовую ферментацию на круговой качалке при 200 об/мин и 28°С.

Общий выход, определяемый способом тонкослойной хроматографии, составлял в среднем на круглодонную колбу 330 мг 9- ОН-АД.

Пример 2. В соответствии с условиями примера 1 по культуре в пробирках и предварительной культуре культивируют микроорганизмы штамма Mycobacterium vaccae ZIMET 11052.

Десять круглодонных колб вместимостью 500 мл загружают каждую 4 г сырого сорбента вышеуказанной характеристики, 500 мг препарата из ситостерина и ПАВ (500 мг ситостерина. 50мг ПАВ группы В, растворенные в бензене и лиофилизированные)и 50 мл ферментационной среды состава согласно примеру 1.

Выход 9-ОН-АД составлял в среднем 90,6 мг на круглодонную колбу после 96-часовой ферментации на круговой качалке при 28°С.

Пример 3. Микроорганизмы штамма Mycobacterium vaccae ZIMET 11053 выращивают в соответствии с условиями примера 1 на пробирочной и жидкой предварительной культурах.

Условия для ферментационной культуры подбирают по аналогии с примером 1, однако отпадает добавка сорбента.

После 96-часовой ферментации на круговой качалке при 200 об/мин и 28°С было получено в среднем 120 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу.

Пример 4. Культивирование микро- организмов штамма Mycobacterium vaccae 2IMET11053 осуществляют на пробирочной и жидкой предварительной культурах в соответствии со стандартом, названным в примере 1.

В десять круглодонных колб вместимостью 500 мл помещают по 5 г сорбента типа органического полимера (возникшего из этилвинилового и дивинилового бензена, без полярных групп). 5 мл препарата из си- тостерина и ПАВ вышеуказанного состава и 50 мл ферментационной среды (состав как по примеру 1).

Ферментацию осуществляют в течение 72 часов при 28°С на круговой качалке после стерилизации колб при 120°С в течение 20 минут и последующего засева.

Из культуральной жидкости и сорбента получают в среднем по 108 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу.

Пример 5. Микроорганизмы штамма Mycobacterium vaccae ZIMET 11053 предварительно выращивают согласно условиям примера 1 в культуре в пробирках и жидкой культуре. Условия для ферментационной культуры выбраны по аналогии с примером 1, однако препарат из ситостерина и. ПАВ содержит ЛАВ ферман (блочные полимеры полиэтиленоксида/полипропиленоксида с содержанием 30-70% полипропиленокси- да, выпуск комбината Хемише Верке Бу- на).

После 96-и часовой ферментации на круговой качалке при 200 об/мин и 28°С образуется в среднем 295 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу.

П р им е р 6. В таких же условиях, как указано в примере 1, вместо 7 г сорбента используют только 1 г сорбента на круглодонную колбу. Средний выход 9-ОН-АД со- ставляет 170 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу.

Пример 7. В таких же условиях, как указано в примере 1, вместо 7 г сорбента используют 10 г сорбента на круглодонную колбу. Средний выход 9-ОН-АД составляет 310 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу.

Пример 8. Ферментационные смеси, содержащие 5 г сорбента на круглодонную колбу, 3 мл суспензии ситостерина и исполь-

зуемые в таких же условиях, как указано в примере 1, дают средний выход 9-ОН-АД в 135 мг на круглодонную колбу.

Пример 9. В остальном в таких же условиях, как указано в примере 1, используют 10 г сорбента и 13 мл суспензии ситостерина.

Формула изобретения

1.Способ получения 9 сс-гидроксилан- дрост-4-ен-3.17-диона путем микробиологической трансформации стерина микроорганизмом вида Mycobacterium vaccae в аэробных и стерильных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, отличающийся тем, что для трансформации используют штамм Mycobacterium vaccae ZfMET 11052 или штамм Mycobacterium vaccae Zl MET 11053.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что стерин вводят в виде препарата из ситостерина и поверхностно-активного вещества в соотношении 10:1.

3.Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и- й с я тем, что в качестве поверхностно-активного вещества используют вещество из группы блочных сополимеров полиэтиле- ноксида (полипропиленоксида) с содержанием 30-70% полиоксипропиленгликоля.

4.Способ по лп. 1 и 2. о т л и ч а ю щ и- й с я тем, что в качестве поверхностно-активного вещества используют вещество из группы аддуктов полиэтиленоксида (полипропиленоксида) N.N -тетра(оксипропилп- ропиол)-м -(2-оксипропил)-диэтиле- нтриамина.

5.Способ по пп. 1-4, отличающий- с я тем, что стерин вводят в питательную среду в концентрации от 1 до 25 г/л.

6.Способ поп. 1,отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, трансформацию проводят в присутствии сорбента, представляющего собой органический полимер, в концентрации от 10 до 160 г/л, затем сорбент отделяют от культуральной жидкости, злюируют ацетоном и из элюата перекристаллизацией выделяют целевой продукт.

7.Способ по пп. 1-6, отличающий- с я тем, что в качестве сорбента используют полимер, полученный из этилвинилового и дивинилового бензола без полярных групп или с полярными группами на основе акрилового эфира.

Таблица 1

Использование: фармацевтическая промышленность для получения высокоактивных стероидов прегнанового типа. Сущность изобретения: стерин - как тако- вой или в виде препарата из стерина и поверхностно-активного вещества (ПАВ) в соотношении 10:1 вносят в водную ферментационную среду и подвергают микробиологической трансформации штаммом Mycobacterium vaccae Zl MET 11052 или штаммом Mycobacterium vaccae 11053. В качестве ПАВ используют блочные сополимеры полиэтиленоксида (полипропиленоксида с содержанием 30-70% полиоксипропи- ленгликоля или аддукты полиэтиленоксида) полипропиленоксида М,ы -тетра-(оксипро- пил-пропиол)-М -(2-оксипропил)- диэтилентриамина. Стерин вводят в питательную среду в концентрации от 1 до 25 г/л. При необходимости в ферментационную среду добавляют сорбент типа органического полимера в концентрации от 10 до 160 г/л. Затем сорбент отделяют от кулъту- ральной жидкости, элюируют ацетоном и целевой продукт выделяют путем перекристаллизации. В качестве сорбента используют полимер, полученный из ЭТИЛВИНИЛ.ОБОГО и дивинилового бензола без полярных групп или с полярными группами на основе акрилового эфира. Получают продукт с хорошим выходом при непродолжительной ферментации с использованием непатогенного штамма микроорганизма. 6 з.п. ф-лы, 3 табл.

Углеводороды или сахарные спирты

р-арэбиноза

D-ксилоза

D-глкжоза

Р-манноза

0 -галактоза

Р-фруктоза

L-рамноза

Мальтоза

Лактоза

Сахароза

-сорбит

-маннит 1езоинозит

Амиды

А цетамид

Ёензамид

Мочевина

Изоникотинам

1-|икотинамид

Г иразинамид

Салициламид

флантоин

СукцинамиД

Малонамид

Mycobacterlum vaccae ZIMET

11052

11053

+ +

+ + +

+ + +

Таблица 2

Mycobacterium vaccae ZIMET

11052

11053

+

+ +

+ +

+ +

Таблица 3

Перечень параметров продуктивности при получении 9-ОН-АД при помощи штаммов Mycobacterium vaccae ZIMET 11052 и ZIMET 11053 по сравнению с опубликованным состоянием техники