Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. -продуцент моноклональных антител к инсулину человека Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к бибтехнб- логии и касается получения- монрклональных антител к инсулину человека с помощью нового штамма гибридом.

Цель изобретения - получение шта)м ма гибридных культивируемых клеток мы пш MUS muscuius, позволянмдего получать моноклональные антитела fc более высрКИМ сродством к инсулину человека.

Новым штамм гибридных культивир уе мых Клеток MUS musculus Е6Ё5 продуцирует моноклональные антитела Е6Е5 к инсулину человека с констан той связывания 7,5 Ю л/моль. Конг центрация антител,продуцируемых штаммом MUS musculus ЕбЕ5, составляет 30 мкг/мл в культуральной жидкости и 12 мг/мл, в асцитной жидкости.

Штамм получают следуюищм образом.

Мышей линии BALB/C иммунизируют инсулином человека в полном адьюванте Фройнда в , подушечки задних,лапок |(по 50 мкг на мьш1ь). Чистота инсулина проверена электрофоретически и составляет 98%. На 13-й день мышей иммунизируют в подушечки задних лапок тем же Количеством инсулина в неполном адьюванте Фройнда. На Т6-и день мышей забивают, достают подколенные лимфоузлы :и клетки лимфоузлов сливают с клетками шеломы РЗ.Х63. Ag 8.653 с помощью по лиэтиленгликоля ПЭГ 2000 (Merck). Соотношение клеток лимфоузлов и клеток миеломы составляет 5:1. После слияния клетки рассевают в лунки 96ячеечного планшета Nund в количестве 100 тыс. клеток на лунку, в которые предварительно высевают перитрнеальные макрофаги мыши по 5000 клеток на лунку. Селекцию гибридом ведут в среде ГАТ /RPMI 1640/ содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин/. Отбор растущих культур клеток, секретирующих ангтитела нужной специвиачности проводят с помощью -радиоиммунологического анализа : в лунки полихлорвинилового планшета, покрытые антителами против иммуноглобулинов мыши, вносят культу ральные жидкости растущих культур клеток, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, лунки npoMMBaiOT 1и инку-; бируют с 125 меченьм инсулином. Лунки нарезают и просчитывают в гамма счетчике. Гибридому, секретирующую аититела к инсулину, дважды клонируют t методом ЛИМ11 тирующих разведений, т.е. клетки рассеивают в лунках 9б-йчеечных планшетов из расчета 1 клетка на лунку в ростовой среде (RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, j4 мМ L-тлютамина, 1% пирувата натрия, 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мп стрептомицина). Выросшие клоны тестируют на секрецию антител. Доля клонов сохраняющих продукгщю антител заданной специфичности, составляет 100%. Штамм обозначают Mus musculus. Штамм; Б6Е5 хранится и Специализированно коллекции перевиваемых соматических kneTOK позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 439 Д и характеризуется следующими признаками. Культуральные свойства. Среда для культивирования - .RPMJ 1640 или DMEM.C 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глютамина, 1% пирувата натрия, 50 ЕД/мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют при З7с в атмосфере, содержащей 5% СО Для выращивания штаммов можно использовать стеклянную и. пластиковую культуральную посуду. Характер роста - стационарная суспензия lacTOTa пассирования сут.Кратность ассева 1:3-1:4. При введении мьшгам IALB/C, предварительно обработанных , фистаном, по 1 млн. клеток, асцит об азуется через 10-15 дней. Стабильная продукция наблюдается в течение 7 пас сажей на мышах. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:256, в асцитической - 1:500000. 17 6 ; .7 Продуктивность, ; Концентрация антител, продуцируеMiDc штаммом Е6Е5, составляет в культуралЁНой зЬадкости 30 мкг/мп, в а ;цитной жидкости 12 мг/мл. Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 20 пассажей в культуре и 7 пассажей на ткивотных, если гибридрна перевивается. Контаминация. Бактерий и гриб в культурах не обнаружены при длительном наблюдений Н посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрадшвании красителями на ДНК и тимидиноврм пррмечивании культуральной среды. Консервация клеток. Клетки штаммов замораживают после 2 Н 3 клонирования на 10 и 15 пассажах в культуре и после роста в виде асцитнрй рпухрли в мышах. Крирза11Ц тная среда 50% ррстрврй среды, 40% эмбрирнальной телячьей сыврротки и 10% диметидсульфркеида. Режим замрраживания: клетки в кри- озащитной среде помещают на сутки в хрлрдильник 1фи -70, после чего переносят в ЖИДКИЙ азот. Выживаемость клеток прсле размрраживания составляет 50%. . ,;,. . .,: ;;. . V . / . ,-. Прлез п.1й продукт. Моноклональные антитела IgGI класса. Специфичность - инсулин человека, проннсулйн человека. Ыетрд оценки сохране1шя специфичности: кроличьи и антитела против, иммуноглобулинов мыши сорбируют на-поверхности лунок гибко- го планшета, в лунки вносят супернатанты клеток ЕбЕ5, затем планшет отмывают, и в лунки вносят 125/ инсулин, планшет вновь отмьшают, лунки вырезают и просчитывают в гамма-счетчике. Аффинность антител составляет 7,5 X 1 о л/моль. Испрльзрвание штамма Е6Е5 для получения антител к инсулину. П р и мер 1. Получение антител Е6Е5 с прмрщью штамма гибридом ЕбЕ5. Для получения мрнрклональных антител Е6Е5 клетки штамма гибридрм ЕбЕ5 вьфащивают в пластикрвых флаконах на среде для культивирования: RPMI 1640 (или DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сывррртки, 4 мМ L-глютaминaJ 1% пирувата натрия, 50 ЕД/мп пенициллина, и 25 мкг/мл стрептоь инина. КРНцентрация клеток в среде не должна /мл. Когда число кле- превышать 05 млн,

Изобретение относится к биотеХйог» логии и касается получения моноКлог :нальных антител к инсулину человека спомощью нового штамма гибридом. Цель изобретения " получение штамма гибри- домы - продуцента моноклональных анти~ тел с более высоким средством к инсулину. Ытамм Е6Е5 получают гибридизацией иммунных клеток лимфоузлов мы;1Ш BALB/C с клетками миеломы РЗ-ХбЗ- . Ag8.653. Штамм Е6Е5 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР "ОД номером ВСКК(П) Д39Д. Клетки штамма Е6Е5 растут на среде RPMI 1640 или DMEM с 10% амбриональной телячьей сыворотки. Концентрация антител, продуцируемых штаммом ЕбЕ5, составляет в культуральной жидкости 30 мкг/мл, в асцитной жидкости 12 мг/мл. Аффинность антител составляет 7,5*10'' л/моль.г 1(л