Способ получения смеси 5 @ -рибонуклеотидов из раствора нуклеиновых кислот, содержащего дезоксирибонуклеиновую кислоту Советский патент 1988 года по МПК C07H21/00 

4

оо

СП

СП

00

Изобретение относится к медицине, точнее к способам получения 5- рибонуклеотидов. Цель изобретения - предупреждение разложения дезокси- рибонуклеиновой кислоты и упрощение способа. Для этого фермент 5 -фосфо- диэстеразу иммобилизуют, образуя ко- валентную связь между ферментом и полимерным носителем с каналами от 100 нм и объемом пор 2-3 м/г (например, эпоксидный носитель R, являющийся сополимером из глицидилметакрила- та, аллилглицидилового эфирга, метак- риламида и метилен-бис-метакриламида. Раствор природных нуклеиновых кислот, содержащий дезоксирибонуклейновую кислоту с мол.м, более 100000 и рибонуклеиновую с мол.м, менее 50000, пропускают через колонку с 5 -фосфо- диэстеразой. Дпя получения инозин- монофосфата гидролизат пропускают через колонку с фиксированной на носителе 5 -дезаминазой. Результат соединения определяют, измеряя ферментативную активность на полимере и в промывочной воде. 1 з.п. ф-лы. СО

Сл1

I Изобретение относится к области едиЦины, в частности к способам по- Ьучепия 5 -рибонуклеотидов. I Целью изобретения является преду- Ьреждет1ие разложения дезоксирибонук- Ьеиновой кислоты ii упрощение способа а счет использования природных нук- Ьеиновых кислот, содержащих дезокси- Ьибонуклеиновую кислоту с мол.м. бо- fiee 100,000, и рибонуклеиновую кислоту с мол.м. менее 50000.

Способ осуществляется следующим образом.

П р-и м е р 1. Фермент 5 -фосфодиэстеразу иммобилизуют путем образования ковалентной связи между ферментом и полимерн 1м носителем, в качестве которого используют такие полимерные пористые носители, которые имеют каналы диаметром от 100 им и объем 1 пор 2-3 мл/г, предпочтительно 2,5 мл/г Особенно хорошим носителем для 5- фосфодиэстеразы является эпоксидный носитель (R) Ойпергит С, представ- ляющий собой сополимер из глицидил- метакрилата, аллилглицидилового эфи-- ра, метакриламида и метилен-бис-мет акриламида. Фермент соеди гяют с полимерным носителем при условиях, не, влияющих на стабильность фермента. Результат соединения определяют путем измерения ферментативной активно сти на полимере и в промывочной воде. Троцесс осуществляют следующим образом.

2 г 5 -фосфодиэст разы (нуклеазы IR р, фирма Амано) растворяют в 80 мл Л М буферного раствора фосфата с рН ;7,8. Раствор подают в колонку, содер- 20 г эпоксидного носителя (Ой- |пергит с) с каналами диаметром до ilOO нм и объемом пор 2-3 ют/г, слег- |ка перемешивают и оставляют на 3 дня 1при комнатной температуре. Полимерную :смолу отфильтровывают и промывают следующими жидкостями: бидистиллятом ;1 Ы раствором ЫаНСОз; 0,5 М раствором Nad; бидистиллятом; 1 М раствором HCi; бидистиллятом. Промытую смолу помещают в 0,05 М ацетато-бу- |ферный раствор и загружают в стеклянную колонку с двойной рубашкой диа- метром 2,6 и высотой 20 см. Для измерения активности иммобилизованной ;5 -фосфодиэстеразы субстрат-раствор, |состоящий из 4% РНК и 0,1 мН раство- ра сульфата цинка и 0,05 М ацетата- буферного раствора с рИ 4,5, про

,,

5 0 5

0 5

0

5

0

5

пускают через колонку со скоростью- протекания (SV) 20-30h

,при 55 с, Количество мононуклео- - тидов определяют фотометрически с по- мощ.ью жидкостной хроматографии на колонке (reversed phase сили- кагель, гидрофобизированньп алифатическими соединениями с углеводной цепочкой, содержащей до 18 атомов углерода) . Элюирование осуществляют водой, подкисленной фосфорной кислотой до рН 2,1, при скорости потока 2 мл/ /мин. Проявление осуществляют с помощью УФ-излучения с длиной волны 254 нм.

П р и м е р 2. Водный раствор, содержащий 0,9% (вес/обьем) природной нуклеиновой кислоты, в котором количество РЫК и ДНК находится в соотношении 4:1 и ДНК имеет мол.м. более 100000, а РНК - менее 50000, доводят до рН 4,5 ледяной уксусной кислотой и пропускают через колонку с иммобилизованной 5 -фосфодиэстеразой (согласно примеру 1) при 55 С. Скорость потока через колонку регулируют таким образом, чтобы осуществлялось 100%-ное превращение РНК. Для выделения 5 -рибонуклеотидов разрушенньш раствор нуклеиновых кислот п ропуска- ют через колонку, заполненную слайо- основной нo} ooб eннoй смолой DUOLIIE А 7 в ацетатной форме. Для очистки и вьщеления ДНК элюат с колонны концентрируют с помощью ROMICON-патро- нов с по-лым волокном (полисульфоновое волокно, граница выделения 100000) и подвергают диализу по отношению к воде,, не содержащей солей. .Через мембрану могут проходить молекулы с мо- лекулярным весом менее 50000. ДНК осаждают, доводя рН раствора до 2,0 и после высушивания получают, в виде белого порошка. Отделение смеси 5.- рибонуклеотидов осуществляют путем селективной десорбции ацетатными растворами повьшающейся концентрации: СМР: 0,1 н. уксусная кислота; AMP: 0,3 н. уксусная кислота; VMP:. н. ацетат аммония; GMP: 0,5 н. ацетат аммония. Общий 5 -рибонуклеотидов 75-80%.

П р .и м е Р З. Водный раствор, содержащий 3% (вес/объем) природной нуклеиновой кислоты, в котором количество РНК и ДНК находится Б соотношении 4:1 и ДНК имеет мол.м. более 100000, а РНК - менее 50000, доводят

p no 4,5 ледяной уксусно 1 кислотой и при 55 С пропускают чере ч колонку с иммoбнлизoIзaf нoй 5 -фосфоднэстера- зой соглаС Но примеру 1 . Скорость потока через колонку регулируют таким образом, чтобы осуществлялось 100%- ное превращение РНК (например, при активности 265 г РНК на 1 л фиксированного фермента в час раствор пропускают через колонку с помощью насоса со скоростью 2,12 л/ч). В полученном растворе содержится также 5 -аде- нозинмонофосфат. Для получения из него 5 -инозинмонофосфата раствор пропускают через вторую колонку с иммобилизованной 5 -дезаминазой (также согласно примеру 1). Элюат с колонки концентрируют с помощью мембран на основе полых волокон и прошедшую через мембрану часть доводят до рН 1,5- 2,0 концентрированной соляной кислотой, затем пропускают через колонку, заполненную гранулированным активированным углем, адсорбируют 5 -рибо- нуклеотиды. Из оставшейся части при рН 2,0 осаждают ДНК и затем высушивают. Выделение смеси 5 -рибонуклеоти- дов осуществляют путем селективной

10

кис. итой, Осажденнук ДИК отфипьт- ровывают и высушивают.

Общий вьгход смрси З -рибонуклеоти- дрв, содержащей ДНК, составляет 75- 80Z. . . , Таким образом, способ получения 5 -рибонуклеоТидов не требует предварительной очистки РНК.и тем самым не влечет за собой разрушение ДНК. Кроме того, раствор, полученный гидролизом наряду с 5 -рибонуклеотидами и неразрушенной ДНК содержит также еще примеси протеинов и солей ферментов, которые можно выделять очисткой.

Раствор, полученный гидролизом природных нуклеиновых кислот, содержащий также 5 -аденозинионофосфат, можно испольаовать непосредственно для получения 5 -инозинмонофосфата, применяемого в качестве усилителя вкусовых свойств, при этом не требуется предварительное вьщеление ДНК.

25 Форм у, л а изобретения

15

20

миака. Общий выход 5 -рибонуклеоти- дов 75-80%.

П-р и м е р 4. Водньй раствор 2%

пропускают через колонку с и мoбнли- зованной 5 -фосфодиэстеразой. Элюат с помощью NaOH доводят до рН 8,5 и

с целью адсорбции нуклеотидов пропускают через колонку, заполненную силь-

0

кис. итой, Осажденнук ДИК отфипьт- ровывают и высушивают.

Общий вьгход смрси З -рибонуклеоти- дрв, содержащей ДНК, составляет 75- 80Z. . . , Таким образом, способ получения 5 -рибонуклеоТидов не требует предварительной очистки РНК.и тем самым не влечет за собой разрушение ДНК. Кроме того, раствор, полученный гидролизом наряду с 5 -рибонуклеотидами и неразрушенной ДНК содержит также еще примеси протеинов и солей ферментов, которые можно выделять очисткой.

Раствор, полученный гидролизом природных нуклеиновых кислот, содержащий также 5 -аденозинионофосфат, можно испольаовать непосредственно для получения 5 -инозинмонофосфата, применяемого в качестве усилителя вкусовых свойств, при этом не требуется предварительное вьщеление ДНК.

5

25 Форм у, л а изобретения

выделением продукта ионообменной или адсорбционной хроматографией, о т - личаю.щийся тем, что, с целью предупреждения разложения дезокс рибонуклеиновой кислоты и упрощения способа, раствор природных нуклеино- вых кислот, содержащий дезоксирибо- нуклеиновую кислоту с мрл.м. более 100000 и рибонуклеиновую кислоту с мол.м. менее 50000, пропускают через

пор 2-3 мл/г.

колонку с 5 фосфодиэстеразой, предварительно иммобилизованной .на макропористом полимерном носителе с каналами диаметром до 100 нм и объемом