Способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот Советский патент 1989 года по МПК C12N11/00 

СН-агароза (1:100 - 1:1А5) позволяет обеспечить эффективную и многократную регенерацию сорбента. Проведение 10. циклов регенерации не. приводит к уменьшению эффективности иммобилизации нуклеиновой кислоты. Так как без регенерации сорбент может быть использован 5-6 раз для вьщеления ферментов, то за счет его регенерации кратность использования возрастает в 10 раз до 50-60 раз. Положительный эффект заключается в том, что при использовании предложенного способа получения иммобилизованных нук- .леиновых кислот становится возможной ;простая и эффективная -регенерация целевого продукта, ,в процессе которой заменяется только нуклеиновая кислота, а матрица со связанным носи телем остается неизменной.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П .р и м е р 1. Стадия А. Приготоление этидиумбромидагарозы,

3 г СН-агарозы (Олайнский химический завод) суспендируют в 10 л дистиллированной воды рН 4-6,0. К суспензии добавляют 13,3 мл этидиум- бромида, растворенного в 10 мп дистиллированной воды. Отношение этиди-т умбромид: СН-агарозы равно 1:100.

К полученному раствору при постоянном перемешивании добавляют цик- логексил - 3-(2-морфоаминоэтил)-кар- бодиимид мето-п-толуолсульфонат до конечной концентрации О, 1 М, подцер живая рН раствора в пределах 4,5-6,0 в течение 1 ч при комнатной температ .ре. При постоянном перемешивании смесь вьщерживают при комнатной температуре в течение 24 ч. Полученный сорбент отмывают 1 М раствором Nad и этанолЪм до отрицательной реакции на этидиумбромид, определяемой по УФ-поглощению.

Стадия Б. Иммобилизация РНК на i этидиумбромидагарозе.

Этидиумбромидагарозу помещают в хроматографическую колонку и пропускают через нее раствор дрожжевой РНК в 30 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0 с 2,5 М. NaCl до появления оптической плотности, Отмьшают сор- бе1/т 3 объемами этого же буфера, но без NaCl. Затем сорбент промьшают 10 Мм калий-фосфатным буфером рН 8,0 с 2 мМ дитиотреитола (ДТТ), О,2% -нонидет Р-40,10% глицерина. Емкость

0

0

0

0

приготовленной таким образом колонки составляет 55 мг РНК на 1 г этидиумбромид агар озы.

Стадия В. Регенерация этидиумбро- мидагарозы (проводится через 5-6 выделений фермента).

Через колонку с иммобилизованной нуклеиновой кислотой пропускают О,1 М раствор NaOK (3 объема), затем немедленно промывают дистиллированной водой или нейтральным буфером. После этого колонка готова к новой иммобилизации. Колонку можно подвергать

5 длительному хранению и многократной регенерации (10 раз) без изменения свойств сорбента. Сорбент используют для вьщеления РНК-зависимой ДНК-поли-, меразы (ревертазы).

130 мг вируса птичьего миелоблас- тоза суспендируют в 6 мл 10 мМ калий- фосфатного буфера, рН 8,0 с 2 мМ дитиотреитола, 0,2% нонидет Р-40, 10% глицерина. К суспензии вируса поспе5 довательно добавляют при постоянном перемешивании О,6 мл нонидет Р-40, 0,6 мл 10% дезоксихолата натрия, 1,8 мл 4 М раствора КС1. Смесь вьздер ;живают при 0°С в течение 15 мин, разводят в 10 раз исходным буфером и наносят со скоростью 15 мл/ч на колонку с этидиумбромид РНК-агарозой, уравновешенную в том же буфере. Коп- лонку промывают-; 50 мл исходного буфера и элюируют фермент линейным градиентом КСе от 10 до 2500 мМ. За единицу активности принимают включение 1 нМ тимидинмонофосфата(н тМФ) в кислотонерастворимьй продукт при 37 С в течение 10 мин. Выход фермента по активности 85%. Общее количество фермента 4500 единиц (по Спигельману). I

Пример 2. Стадия А. проводится так же, как в примере 1.

Стадия Б. Иммобилизация РКН на этидиумбромидагарозе:.

Этидиумбромидагарозу помещают в хроматографическую колонку и пропускают через нее раствор дрожжевой РНК в 20 мМ калий-фосфатном буфере рН 9,0 с 2,5 М Nad до появления оптической плотности. Отмывают сорбент 3 объемами этого же буфера,, но без NaCl. Затем сорбент промывают 10 мМ . калий-фосфатным буфером рН 8,0 с 2 мМ дитиотреитола, 0,2% нонидет Р-40, 10% глицерина. Емкость приготовленной таким образом колонки сос5

5

0

5

тавляет 60 мг РНК на 1 г этидиумбро- мвдагарозы.

Стадия В. Регеиерацил этидиум ро- мидагарозы (проводится также, как в примере 1). Эффективность иммобили- зации РНК не снижается после 10 цик- ; лов регенерации.

Пример 3. Иммобипизация ДНК на этидиумбромидагарозе.

Этидиумбромидагарозу, приготовленную так, как описано в примере 1, помещают в хроматографическую колонку и пропускают через нее раствор ДНК из тимуса теленка в 30 мМ калий- фосфатном буфере рН 7 с 2,5 М ЫаСГ до появления пика оптической плотности. Отмывают сорбент 3 объемами того же буфера, но без NaCl . Емкость полученного сорбента составляет 62 мг ДНК на 1 этидиумбромидагарозы.

Пример 4. Иммобилизация ДНК на этидиумбромидагарозе.

Редактор О.Волкова

Составитель В.Муронец

Техред М.Дидык . Корректор Л.Бескид

Заказ 4719Тираж 501Подписное

ВНИШ1И Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Этидиумбромидагарозу, приготовленную так, как описано в примере 1, помещают в хроматографическую колонку и пропускают через нее раствор ДНК из тимуса теленка в 30 мМ калий-фосфатном буфере рН 9,0 с 2,5 М NaCl до появления пика оптической плсгнос- ти. Отмывают сорбент 3 объемами того

Q же буфера, но безNaCl. Емкость полученного сорбента составляет 64 мг на 1 г этидиумбромидагарозы. Регенерация колонки с иммобилизованной ДНК проводится, как описано в примере 1.

5 Пример 5. Стадия А. Приготовление этидиумбромидагарозы.

3 г СН-агарозы (Олайнский х :ми- ческий завод) суспендируют в 10 ьш дистиллированной воды рН 4,0 - 6,0.

Q К суспензии добавляют 19,3 мг этидиум- бромида, растворенного в 10 мл дистиллированной воды, и далее по примеру 1. Соотношение этидиумбромида к матрице 1:145.