Способ получения L-карнитина Советский патент 1988 года по МПК C12P23/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

СО

Изобретение относится к бйотех,нологии и касается получения Ь-карни тина. Цель изобретения - повьшение выхода.L-карнитина. Это достигается тем, что бактериальный ,штамм продуцента выращивают на питательной cpe-l да, содержащей в качестве источника углерода и азота 1р бутиробетаин или кротонобетаин, факторы роста в условиях аэрации до максимального накопления целевого продукта с последующим его вьщелением, в качестве бактериального пггамма продуцента используют Agrobacterium НК 4, или Agrobac- terium НК 13, или Agrobacteriura Ж 1331, при этом у-бутиробетаин или кротонобетаин вводят в количестве 0,1-10,0%.

4 00

ел

ел

со

см

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения L-карни- тина.

Целью изобретения является повьпве- ние выхода L-карнитина.

Способ заключается в следующем.

Предлагаемые микроорганизмы способны вырабатывать из кротонобетаина или -у-бутиробетаина L-карнитин, не разлагая последнего. Все эти микроорганизмы могут быть продуцентами при том условии, что они мутированы по следующему двухстадийному методу с.елекцииг,

а)микроорганизмы, вь ращияае1 б|1е на бетаине, у-бутиробетаине, крото- нобетаине и L-карнитине в качестве источника углерода и азота, мутируют известными приемами;

б)из культуры мутированных ьикро- организмов, полученной в результате процесса культивирования, селекциош - руют устойчивые кикроорганизмы, не разлагающие Ь-карнитина и вьфащивае-; ьше на бетаине, кротобетацне,

. тиробетаине. Выра1(ивание штаммов, растуи х на бетаине, кротонобетаине.

Описание оггамма Agrobacterium HK 4 (DSM № 2938):

у

,

усло

Mac- SS идном

палочки, частично плеоморфны

1-2 0,5-0,8

+ ,

перитрихаль- ное

у-бутиробетаине в качестве источника углерода и азота, осуществляют путем посева смеси бактерий на кротоноёе- таиновьге питательные растворы, приготовляют таким образом смешанные культуры, а затем по традиционным микробиологическим приемам получают чистые культуры разлагающих кротоко- бетаин микроорганизмы. Мутацию куль тур, растущих на -у-бутиробетаине, кротонобетаине в качестве источника азота и углерода, осуществляют известными методами. Мутированные таким образом микроорганизмы подвергают селекционированию

Микроорганизмом растущим на бутиробетаине или кротонобетаине в качестве источника углерода и азота , является пггамм НК 4 (DSM 2938) и его десценденты и мутанты. Этот штамм 03.03.84 за Р DSM 2938 был депонирован при Неме1Ц(ой коллекции микроорганизмов (Deutsche A.Sanmluitg von Mikroorganismen (DSM) при обществе Gesellschaft fiir Biotechnologische Forschung mbH, Griesebachstrabe, 8 4300 Gottingen, фPГ).

Образование фенилаланин деаминазы орнитйндекарбоксилазы

Проскауера

нитрата+

+

+

+

субстрата

Пигменты

не диффундирующие диффундирукщие . флуоресцирунщие Образование кислоты (тест OF) из глюкозы

анаэробно

фруктозы аэробно - ASS глюкозы + ксилозы-

трегалозы+

этанолаОбразование газа из глюкозы

ONPG+

Образование

аргининдигйдролазы лизиндекарбоксилазы 6 кpoopгaнизмoм, полученным в результате мутации и селекционирования из указанного микроорганизма, которы обладает устойчивостью, не. разлагает L-карнитина, а вь яеляет его и растет на кротон оветаине или --бутиробетаине, является штаммAgrobacteriura НК 13.Это

Описание штамма Agrobactererium НК 13 (DSM № 2903)

у

у

усло

Мас

SS ом агаре

палочки

частично

плеоморфны

1-2 0,5-0,8

+

перитрихаль- ное

+ +

+

+ +

Автотрофный рост на Hj 3-кетолактоза

Рост на бетаине Ь-карнитине v-бутиробетаине кротонобетаине

штамм 23.01.84 был передан обществу Gesellschaft fOr Biotechnologische Torsehung mbH, briesebachstrabe 8,- 4300 Gettingen, ФРГ, на хранение за № DSM 2903 в коллекции Deutsche 8аш- ralung von Mikroorganismen (DSM).

Образование

фенилаланиндеаминазы - орнитиндекарбокСилазы H-zS

Реакция Фогес-Пр

Образование

индоланитрита из ни

Денитрификация

Образование левана

лецитиназыуреазы

Деградация

крахмала; желатина казеинатирозинатвина 80 ДНК эскулина

Продолжение кол

Пигменты

не диффундирующие диффундирующие флуоресцируюпще Образование кислоты

(тест OF) из

глюкозы аэробно анаэробно фруктозы аэробно ASS глюкозы ксилозы

трегалозы

этанолаОбразование газа из

глюкозы

ONPG .

Образование

аргининдигидролазы лизиндекарбоксилаз

Примером устойчивого десцендента микроорганизма НК 13, не разлагающего, а ввделякщего L-карнитин и расту- 1цего на бетаине, L-глутамате и кротонобетаине, L-глутамате и бутиробетаине, глутамате и L-карнитине является штамм НК 1331. Его вьщеляли в виде спонтанно и хорошо растущей ко- лонии мутантов с поверхности плотной

Описание штамма Agrobacterium НК 1331 (DSM №3225):

Форма клеток

Длина, мкм Оирина, мкм Подвижность Жгутикование

I )

Реакция по Граму

Споры

Образование

поли- оксибутирата

оксидазы

каталазы Рост в анаэробных

условиях

4ГС

рН 5,.6

палочкиОбразование частично феннлаланинде- плеоморфны аминазы

1-2орнитиндекарбокси-1

0,5-0,8лазы

+VHIS.перитрихаль- Реакция Фогес-Проскуера

ное Образование

индола

-нитрита из нитрата

Денитрификация

+ f

Образование левана лецитиназы уреазы

Деградация, крахмала желатина казеина

4- +

Продолжение крлонки 2

спользование субстрата

ацетатащтратамалонатаглицинанорлейцина

ксилозы

фруктозы

глюкозы втотрофчый рост

на Н,

3-кетолактоза ост на

бетаине

L-карнитине

J-бутиробетаине

кротонобетаине

L-глутамате и

|сротонобетаине

L-глутамате и

бутиробетаине

L-глутамате и

L-карнитине

+

+

-I

агаровой питательной среды, содержащей L-глутамат и 2«-бутиробетаин, Указанный штамм 08.02.85 бьт передан обществу besellscaft fiir Bio- technologische Forschung mbH, briese- bachstrabe 8, 4300, Gbttingen, ФРГ, на хранение за № DSM 3225 в коллекции Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen (DSM).

+ +

Образование левана лецитиназы уреазы

Деградация, крахмала желатина казеина

Продолжение ко

на агаре Мас- Coukey

на агаре SSна центримидном ага Пигменты

не диффундирующие диффундирующие

флуоресдарующиеОбразойание кислоты

(тест OF) из

глюкозы аэробно анаэробнофруктозы аэробно ASS глюкозы ксилозы

трегалозы

этанола

Образование газа из

глюкозыONPG

Образование.

, аргининдигидролазы лизиндекарбоксилазы В целях осуществления предлагаеого способа получения L-карнитина целесообразно сначала выравнивать предварительную культуру микроорганизма йа стерилизованной среде при аО-ад С при рН 6-8 в течение 20-50 ч. Эта предварительная культура должна содержать в качестве субстрата роста 0,1-10 мас.% -бутиробетаина и кро- тонобетаина, считая на реакционную среду. Т -Бутиробетаин или кротоно- бетаин можно использовать в виде гидрохлоридной соли, свободной внутренней соли или их производных, с помощью приготовленных по данному способу предварительных культур можно засевать питательные среды. Последние должны иметь такой же состав, что предварительные культуры посевного материала. Концентрация подвергаемых реакции кротонобетаина, -у-бугиробе- таина или смесей этих соединений в питательной среде 0,1-10 мас.%. Субстраты роста - холин, глутамат, ацетат, диметнлглицин и бетаин - целесообразно применять тоже в концент4351598

Продолжание колонки 2 тирозина

твина 80 ДНК

эскулина

Использование субстрата ацетата цитрата

малоната

глицина

норлейцина

ксилозы

фруктозы

глюкозы

Автотрофньй рост на Н2

3-кетолактоза Рост на бетаине

L-карнитине

.у-бутиробетаине

кротонобетаине

L-глутамате и кротонобетаине L-глутамате и бу- тиробетаине L-глутамате и L-кгр- нитине

+ f

+ + +

5

0

5

0

5

рациях, соответствующих концентрациям в предварительной культуре.

Клетки можно отделять центрифугированием или фильтрованием и использовать в качестве посевного материала для приготовления.новой культуры. Образовавшийся L-карнитин путем ка- тионообменной хроматографии вьзделяют из всплывающей жидкости и очищают перекристаллизацией.

Пример 1. Вьщеление разлагающего кротонобетаин микроорганизма.

Из почвы нейтральным раствором фосфатного буфера с перемешиванием извлекают микроорганизмы с последую- wfiM отделением крупных компонентов через фильтровальную бумагу. С помощью полученной таким образом смеси бактерий засевают питательный крото- нобетаиновый раствор до легкого помутнения. Через 9 сут помутнение, яв- лякяцееся мерой концентрации клеток, увеличилось в 90 раз. В результате кротонобетаин в растворе уже не об- наоуживался и в нем в качестве про-

рукта деградации доказывались аммо- 1иевые ионы. Из указанной смешанной культуры, прибегая к традиционным {lикpoбиoлorичecким приемам с нсполь- ованием плотной агаровой питатель- :ой средыу приготовляют чистые куль- уры разлагак1|ц;их кротонобетаин мйкро рганизмов. Для проведения дальней- их работ из них выбирают культуру, обозначаемую Agrobactererium Ж 4. ITOT штамм растет на у-бутиробетаи- е, Ь-карнитинё и бетаине.

Пример 2. Вьщеление устойчи ого не содержащего дегидрогеназу арнитина мутанта.

Культуру штамма Agrobactereriura ПС 4 с помощью мутагена Асгidin Mu- agen ICR19t (5 мкг/мл) в сукцинат- ой среде подвергают стабильной му- агенизацки, после чего клетки в це- 1ЯХ экспрессии мутаюш кфащивают на штательиом бульоне, затем переводят етаиновую среду. Промытую культу- у вносят в L-карнитивовую среду, же через несколько часов культура ступала в логарифмическую фазу рос- а. В это время добавляют пенициллин

(15 мг/мп) к D-цнклосерин

0,5 мг/мл), котсфые в качестве про- тивоселекцконирующих агентов умерщв- 1ЯЮТ только растущих бактерий. В ре- ультате выживания накапливались му анты, которые не могли расти на -карнитийе. Через 30 ч число живых леток сокращалось в 100 раз. После упоавки антибиотиков культуру пере- одят в бетаиновую среду. Вьфосшую ультуру разбавляют и распределяют на плотной питательной среде. Отдельные клетки вьфасталш с образованием колоний и,в отдельности подвергались испытанию . В результате выбирают мутант Agrobactererium НК 13. Последний устойчив, не содержит дегидроге- назы карнитина и растет на бетаине. Прорастая на бетаине, диметилглицине, хопине,глутамате или ацетате, этот штамм превращает кротонобетаин или У Фобетаин в L-карнитин и выделяет его.

Пример 3. Предварительную культуру штамма Agrobactererium НК 1 объемом 5 МП культивируют в течение 32 ч при и рН 7,0 в витаминсодержащей минеральной среде, содержа- щей 1 мас.% бетаина и 0,5 мас.Х кро- тонобетаин-хлорида. Эту культуру засеивают в культуру того же состава

, о

0 5

« , 5

5

0

5

объемом 15 л, которую потом выращивают в течение 24 ч в условиях, указанных для предварительной культуры. По прекращении получения L-карнитина удаляют клетки центрифугированием и применяют их затем в качестве посевного материала для приготовления новой культуры. Энзиматическим анализом определяют концентрацию L-карнитина во всплывшей жидкости (19,8 л).

Содержание L-карнитина во всплывшей жидкости 4,26 мг/мл, что составляло по выходу 95,0%. Путем катионо- обменной хроматографии вьщеляют L- карнитин из всплывшей жодкости и очищают его перекристаллизацией.

Пример 4. Щ едварительную культуру штамма Agrobactererium НК 13 объемом 5 л культивируют в течение 32 ч при и значении рН 7,0 в витаминсодержащей минеральной среде (по примеру 1), содержащей 1% холина и 0,6% у-бутиробетаин-хлорида. Эту культуру засеивают в культуру со средой того же состава объемом 15 л, которую потом В1фа1цивают в условиях примера t. По прекращении получения L-карнитина (примерно через 30 ч) отделяют клетки методом микрофильтрации. Клеточную массу используют для дальнейшего получения L-карнитина. Концентрацию L-карнитина в фильтрате (19,6 л) определяют энзиматическим анализом. Содержание L-карнитина в фильтрате 5,3 мг/мл. Это соответствовало аналитическому выходу в 97,6%, считая на использованное количество 4 -бутиробетаин-хлорида.,

Пример 5. Предназначенный л для приготовления непрерывной культуры ферментер, содержащий 1,5 л витаминсодержащей минеральной среды (по примеру 1) с 1,5% бетаина и 1,0% у-бутиробетаин-хлорида, загружают 150 мл предварительной культуры Agrobactererium НК 13 на той же-среде. После а:эробного выращивания в тече- 1ше 20 ч при 30°С и рН 7,0 культура достигала полного роста..Потом клетки отделяют путем центрифугирования. Согласно энзиматическому анализу всплывшая жидкость содержала 8,8 г L-карнитина на литр кулктуры;

Следует отметить, что количество 0,1-10% является существенным, так как только в этом случае достигает- ся повышение выхода. При количествах;

n143515912

выше 10% будет иметь место осмоти-робетаин или кротонобетаин, факторы

ческое давление клеток.роста в условиях аэрации до максиДанный способ позволяет повысить .мального накопления целевого продуквыход L-карнитина на 15%. .е последующим его вьщелением,

отличающийся тем, что,

Формула изобретенияс целью првьппения выхода Ь-карнитина,

,.в качестве бактериального штамма-проСпособ попучения L-карнитина, пре-дуцента используют Agrobacterium

дусматривающий выращивание бактери- foНК 4, или Agrobacterium НК 13, или

ального штамма-продуцента на пита-Agrobacterium НК 1331, при этом «- тельной среде, содержащей в качествебутиробетаин или кротойобетаин вводят

источника углерода и азота у-бути-в количестве от 0,1 до 10,0%.