Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения ДНК, кодирующей гормон роста рыб, получения рекомбинантных ДНК, кодирующих данных гормон, а также способа получения полипептидного гормона роста рыб с использованием микроорганизма.
Сущность изобретения состоит в следующем.
Полную РНК получают из гипофиза лосося (Omorhynchus Кегэ)и пропускают через колонку, заполненную олиго (дТ) целлюлозой, для выделения РНК, имеющую поли- аденилировую кислоту (поли (А) РНК). Дву- нитевую ДНК, используя поли (А) РНК в качестве матрицы и ревертазы. Рекомби- нантную ДНК синтезируют, используя In vitro технологию рекомбинантной ДНК. вставляя синтезированную ДНК в векторную ДНК, трансформируют полученными ДНК штамм Escherichla coll.
Ниже подробно поясняется способ получения ДНК и рекомбинантной ДНК изобретения.
У пойманных лососей удаляют гипофиз, который сразу же замораживают в жидком азоте, К замороженному гипофизу добавляют тиоцианат гуанидина, после чего гипофиз размельчают и солюбилизуют, Затем солюбилизованный гипофиз помещают в слой раствора CSC и подвергают ультрацентрифугированию для получения в качеств осадка полной цитоплазмической РНК, Или же к солюбилизованному матери- злу добавляют в месте с тиоцианатом гуанидина LiCI для выделения в качестве осадка только РНК.
Выделенную РНК растворяют в изотоническом растворе NaCI или KCI (например, 0,5 моля) и пропускают через колонку, заполненную олиго (дТ) целлюлозой, с адсорбированием в колонке иРНК, имеющей полиаденилированную кислоту (поли (А)). Вымывание проводят водой или гипотони- ческим солевым раствором, например 10 мМ буферной смеси (трис-HCI) с выделением иРНК, имеющей поли (А).
Синтезируют векторную затравку. Вектор, например, pCDVI, обрабатывают Kpn I в соответствующем растворе, например, растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 7,5, 10 мМ), MgCl2 (например, 6 мМ), NaCI (например, 10 мМ), для удаления pCDVI на участке Kpnl. ДНК инкубируют с концевой дезоксинуклеотидилтрансфера- зой при подходящей температуре (например, 37°С) в течение подходящего периода (например, 20 мин) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 6,8, 30 мМ), кокодилат натрия (например, 140 мМ), CoCl2 (например, 1 мМ), дитиотреитол (например, 0,1 мМ), дТТФ (например, 0,25 мМ) для присоединения около 60 остатков тимидина на обоих З -концах векторной ДНК. Затем ДНК обрабатывают в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 7,5; 10 мМ), MgCte (например, 6 мМ), NaCI (например, 100 мМ). Раствор фракционируют с помощью низкотемпературного гелевого элек- трофореза на геле агарозы (в дальнейшем сокращено называемом методом НТТ) с целью выделения фрагментов ДНК примерно в 3,1 кВ. Затем ДНК растворяют в гипертоническом растворе NaCI или KCI (например, 0,5 М) и пропускаютчерез колонку, заполненную поли (дА) целлюлозой с адсорбированием в колонке только молекул векторной затравки, имеющей поли (Т). Вымывание проводят водой или гипотониче- ским солевым раствором, например буфером трис-HCI, для выделения молекул только векторной затравки с поли (Т).
Затем синтезируют связующую ДНК. Например, pLI ДНК обрабатывают Pstl в
подходящем растворе, например, растворе, содержащем буфер трис-HCI (например. рН 7,5; 10 мМ), MgCl2 (например, 6 мМ), NaCI (например, 50 мМ) для удаления pL1 на участке pstl. Затем ДНК обрабатывают так же, как при синтезе векторной затравки, за тем исключением, что вместо дТТФ добавляют дСТФ и вводят примерно 15 цепей олиго (дГ). Обрабатывают ДНК с помощью Hind III в подходящем растворе, например, растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 7,5; 10 мМ), MgCl2(например, 6 мМ), NaCI (например, 60 мМ). Фрагмент ДНК примерно в 0,5 кВ фракционируют электрофорезом на геле агарозы и выделяют на ЕАЕ-бумаге. Тем самым получают связующую ДНК.
Полученные поли (А) РНК, векторную затравку и связующую ДНК используют для синтеза кДНК, который заключается в следующем. Поли (А) РНК и векторную затравочную ДНК вводят в реакцию с ревертазой при подходящей температуре (например, 37°С) и в течение подходящего периода времени (например, 40 мин) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 8,3; 50 мМ), MgCl2 (например, 8 мМ), KCI (например, 30 мМ) дитиотреитол (например, 0,3 мМ), дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ (например, каждого по 2 мМ). Примерно 15 олиго- (дЦ)-цепей присоединяют к З -концам полученной РНК-ДНК двойной нити в тех же условиях, что и в случае присоединения (дТ)- цепей к векторной затравке, за исключением того, что вместо дТТФ применяют дЦТФ. В подходящем растворе, содержащем буфер трис-HCL (например, рН 7,5; 10 мМ), MgClz (например, 6 мМ), NaCI (например, 60 мМ), ДНК обрабатывают Hind III. Ранее полученную связующую ДНК смешивают с ДНК и приготовленную смесь инкубируют ДНК- лигазой E.coll при подходя щей температуре (например, 12°С) в течение подходящего периода времени (например, 16 ч) в растворе, содержащем буфер трис-HCI (например, рН 7,5; 20 мМ), MgCte (например, 4 мМ), ()2SCM (например, 10 мМ), KCI (например, 0,1 мМ) и/ -никотинамидадениндинук- леозид -НАД) (например, 0,1 мМ) для приготовления кольца кДНК и связующей ДНК. К реакционному раствору добавляют 40 мкМ (конечная концентрация) каждого: дАТФ, дТТФ, дГТФ м дЦТФ. Для замещения РНК-части ДНК и получения рекомби- нантной плазмиды, содержащей двунитевую кДНК. добавляют ДК-лигазу, ДНК-полимеразу 1 и рибонуклеазу Н. Escherichia coll.
Штамм Escherlchia coll, например, Esch erlchia coll с 600 SF8, трансформируют
с помощью полученной рекомбинантной плазмиды. Поскольку в указанной плазмиде имеется ген устойчивости к ампициллину, трансформант Escherichla coll также устойчив к амплициллину,
Отбор штамма микроорганизма, несущего новую рекомбинантную плазмидную ДНК с геном, комплементарным иРНК гормона роста рыб, из устойчивых к ампициллину (Ап) проводят следующим образом. Полученный трансформант фиксируют на фильтре из нитроцеллюлозы и с ним гибри- дизируют искусственную пробу, имеющую ДНК-последовательность, которая была задана последовательностью аминокислот известного полипептидного роста лосося, с целью отбора трансформанта, проявляющего повышенную гибридизацию.Пробу ДНК синтезируют обычным триэфирным методом. Рекомбинантную плазмиду, комплементарную иРНК гормона роста лосося, идентифицируют вышеуказанным методом.
Полученными таким способом рекомби- нантными плазмидами являются pS GH1 и pSGH14, Плазмиды используют в качестве источника ДНК, кодирующей гормон роста лосося.
Способ получения полипептидного гормона роста лосося экспрессией ДНК, кодирующей гормон лосося, в микроорганизме состоит в следующем:
ДНК, кодирующую гормон роста лосося, отсекают от плазмиды, несущей ДНК, и вставляют в векторную ДНК. Полученной рекомбинантной ДНК трансформируют микроорганизм и трансформант культивируют с целью накопления в питательной среде полипептидного гормона роста лосося. Затем из культуры выделяют гормон роста лосося.
Примерами плазмид, содержащих ДНК, кодирующую гормон роста лосося, являются плазмиды pSGHCI и pSGHH.
Применяют векторные ДНК, в которые встраивают чужеродную ДНК в рамке считывания от подходящего промотора, например, тгр-промотора, вас-промотора или Р2-промотора, и длину между последовательностью Шайн-Дальгарно (дал ее обозначается как последовательность ЩД) и инициирующим кодоном (АТГ) устанавливают, например, в 6-18 основных пар. Предпочтительно использование векторной ДНК -pGELI.
Рекомбинацию ДНК, кодирующей полипептид, и векторной ДНК осуществляют общеизвестными приемами.
Получают Mboll-S-зИ фрагмент, кодирующий гормон роста лосося, Sall-BamHI фрагмент, а также Hmri lll-BamHI фрагмент
плазмиды pGELI, содержащий триптофано- вый промотор. Искусственную линкерную ДНК получают по приведенной схеме
Hind III И™ 1
5 I ACCTTATCATACAAAAAC Гз
1I-1
3-IATACTATCTTTTTj 5
Me/lie Gtu AS/
I.3
Фрагменты ДНК и линкерную ДНК сши- вают с помощью Т4-ДНК-лигазы получают рекомбинантную плазмиду pSGH1B2, которая кодирует зрелый гормон роста лосося.
Из pSGH1 отдельно получают МЬо II- PVU II фрагмент, кодирудющий область вблизи N-конца зрелого пептида гормона роста лосося, и PVU ll-HInd II фрагмент, содержащий оставшуюся «ДНК и векторную часть. С другой стороны линкерную ДНК получают по приведенной схеме.
Hind IIuSoll
:Ц
С I 3
Г еАССТТАТССААААСА Т А С С,Т Т Т Т Uet ОН/ И5Л
5 Фрагменты ДНК и линкерную ДНК свя- зываютс помощью Т4-ДНК-лигазы и получают рекомбинантную плазмиду pSGHIIBQ. Затем из плазмиды pSGH11B9 получают Hind Ill-Bam HI фрагмент, содержащий зре0 лый пептид гормона роста лосося, а из pCELI получают Hind Ill-Bam HI фрагмент, содержащий триптофановый промотор. Оба фрагмента связывают с помощью Т4-ДНК- лигазы для получения плазмиды pSGHI 1C2.
5 Обработку ДНК ресктриктазами прово-. дят следующим образом: 0,1-2 мг ДНК с О.Т-100 единицами, предпочтительно с 1-3 единицами рестриктазы на 1 мг ДНК в смеси 2-200 мМ; предпочтительно 10-40мМ,трис0 НС (рН 6-99,5, предпочтительно рН 7-8), 0-2/00 мМ NaCl и 2-30 мМ, предпочтительнее 5-10 мМ, MgCl2 при 20-70°С (оптимальная температура зависит от применяемого ограничивающего фермента) от 15 мин до
5 24 ч. Прекращают реакцию обычно нагреванием до 55-75°С в течение 5-30 мин или же инактивацией фермента с помощью такого реагента, как фенол или диэтилпирокарбо- нат.
0Очистку фрагментов ДНК, образующихся в результате гидролиза рестриктазами, проводят методом НТГ или электрофорезом на полиакриламидном геле.
Связывание фрагментов ДНК прово5 дят с помощью Т4-ДН-лигазы (0,3-10 единиц) в смеси 2-200 мМ, предпочтительнее 10-40 мМ. трис-HCI (рН 6,1-9,5, предпочтительнее 7-8), 2-20, предпочтительнее 5-10 мМ MgClz. 0.1-10 мМ. предпочтительнее 0,5-2 мМ, АТФ и 1-50 мМ, предпсчтительнее 5-10 мМ, дитиотреитола при 1-37°С, предпочтительнее при 3-20°С, от 15 мин до 72 ч, предпочтительнее в течение 2-20 ч.
Полученную рекомбинантную плазмиду ДНК вводят вб Eschertchla coll.
Выделение рекомбинантной плазмид- ной ДНК Escerlchia coll осуществляют методом, описанным в примере 1.
Плазмиду ДНК гидролизуют 1-10 видами эндонуклеаз, места расщепления изучают с помощью электрофореза на геле агарозы или на полиакрилоамидном геле. В случае необходимости, последовательность оснований ДНК определяют методом Makam-Gilbert или методом Sanger.
Штамм EscerichacoliK-12HB101 трансформируют с помощью плазмид pSGH11C2 и pSGH1B2, после чего штамм Escherichla coll, несущий pSGH11C2 или pSGH1B2, отбирают из устойчивых к ампициллину колоний. Штамм Escherichia coli, несущий pSGH1B2 или pSGH11C2, культивируют в питательной среде с получением в клетках культуры полипептидного гормона роста рыб.
В качестве питательной среды используют искусственную или естественную среду, если только она подходит для выращивания Escherichla coli или для производства полипепгидного гормона роста рыб.
В качестве источника углерода используют глуюкозу, фруктозу, глицерин, маннит, сорбит и т. д.
В качестве источника азота используют NH4CI, ()2S04, казаминокислоты, дрожжевой экстракт, полипептон, мясной экстракт, боктотриптон, зерновой экстракт и т.
Д.
Кроме того, используют питательные вещества как К2НР04, КНаРСМ, NaCI, MgSGM, витамин Bi и MgClz.
Культивирование проводят при рН 5,5- 8,5 и при аэрации и перемешивании.
В результате культивирования в течение 5-90 ч в культуральных клетках накапливается полипептидный гормон роста лосося. Собранные клетки обрабатывают лизозимом, разрушают неоднократным замораживанием и оттаиванием и подвергают центрифугированию. Полученную таким образом надосадочную жидкость подвергают экстрагированию обычным методом экстракции полипептидов с целью их выделечия.
Детектирование полипептида проводят растворением при нагревании в буфере Saelmmli и действием НДС на полиакрила- мидном геле и окрашиванием реактивов Coomassle Brilliant голубым.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.2г замороженного гипофиза лосося (от 30 особей) разрушают и гомогенизируют в 10 мл раствора, содержащего 4 М тиоцианатагуанидина, 0,5% саркозила, 5 мМ цитрита натрия (рН 7) и 0,1 М / -меркаптоэтанола. Гомогенат пропускают через инжектор на 18 G и помеща0 ют в слой 5,7 М CSCI и 0,6 М ЭДТА (рН 8) по 1,2 мл каждого раствора в ультрацентрифужных пробирках. РНК осаждают центрифугированием при 35000 об/мин в течение 15 ч. Осадок РНК растворяют в растворе
5 трис-НС1 (10 мл, рН 8), содержащем 1 мМ ЭДТА, экстрагируют смесью фенол : хлороформ и осаждают этанолом. 1 мг полученной РНК растворяют в 1 мл 10 мМ трис-HCI (рН 8) и 1 мМ ЭДТА, инкубируют при 65°С в
0 течение 5 мин, добавляют 1 мл 5 М NaCI. Смесь хроматографируют на олиго-дТ целлюлозе (производство P-L Blochemlcals обь- ем колонки 0,5 мл). Абсорбированную на колонке РНК, содержащую поли (А), вымы5 вают раствором 10 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 1 мМ ЭДТА, порциями по 0,2 мл с получением примерно 10 мг иРНК (3-5 фракции). Пример 2. Синтез кДНК и конструирование реком0 бинантной плазмиды.
400 мкг ДНК плазмиды pCDVI добавляют к 300 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5), 6 мМ MgCl2 и 10 мМ NaCI, и затем 500 единиц Kpnl (производство
5 Takava shuzo Co, все использованные ферменты являются продуктом Takava shuzo Co, если нет особых указаний добавляют. Реакцию проводят при 37°С 6 ч. После эктраги- рования смесью фенол: хлороформ ДНК
0 осаждают этанолом.
200 мг ДНК, гидролизованной рестрик- тазой Kpnl, добавляют к 200 мл раствора, приготовленного добавлением 0,25 мМ дТТР к буферу (далее упоминаемого просто
5 как буфер) содержащему 40 мМ какодилата натрия, 30 мМ трис-HCI (рН 6,80), 1 мМ СаСЬ и 0,1 мМ дитиотреитола (далее обозначаемого как ДТТ). Затем добавляют 81 единицу концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы
0 (далее обозначаемой как КдТ) и реакцию ведут 11 мин при 37°С. Таким образом, к 3 концам pCDVI, расщепленной с помощью Kpnl, присоединяют около 67 поли (дТ) цепей. Экстрагируют смесью фенола с хлоро5 формом, из раствора выделяют в результате осаждения этанолом примерно 100 мкг pCDV ДНК, связанной с поли (дТ) цепями. Полученную ДНК добавляют к 150 мл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5), б мМ MgCl2 и 100 мМ NaCI Затем добавляют
100 единиц ECORI и в течение 2 ч при 37°С проводят реакцию. Продукт реакции подвергают НТГ для получения фрагмента ДНК примерно в 3,1 кВ. который представляет собой примерно 60 мкг pCDVI с поли (дТ) цепями. Полученную ДНК растворяют в 500 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС1 (рН 8) и 1 мМ ЭДТА. Приготовленный раствор инкубируют 5 мин при 65°С, после чего при охлаждении льдом добавляют 50 мл 5 М раствора NaCI. Полученную смесь подвергают колоночной хроматографии на олиго (дА) целлюлозе с адсорбированием на колонке ДНК, имеющей достаточное количество поли (дТ)-цепей. Вымывание проводят раство- ром, содержащим 10 мМ трис-HCI (рН 8 ) и 1 мМ ЭДТА, с получением 27 мкг pCDVI с поли (дТ) цепями (далее называемый векторной заправкой).
Затем описанным способом получают линкерную ДНК.
Примерно 14 мкг добавляют к 200 мл буфера, содержащего мМ трис-HCI (рН 7,7), 6 мМ MgCl2 и 50 мМ NaCI. Затем добавляют 50 единиц Pstl и для отсечения pLI ДНК в области Pstl 4 ч при 37°С ведут реакцию. Продукт реакции подвергают экстрагированию смесью фенола с хлороформом и осаждению этанолом с получением 13 мкг рЦ ДНК. усеченной в Pstl-области. Примерно 13 мкг полученной ДНК добавляют к 50 мл КдТ буферу, содержащему 0,25 мМ (конечная концентрация) дГТФ. Затем добавляют 54 единицы КдТ и инкубируют 13 мин при 37°С с присоединением примерно 14 (дГ) цепей у С -концах pLI, усеченной с помощью Pstl. Выделяют ДНК экстрагированием смесью фенола с хлороформом и осаждением этанолом. Полученную ДНК добавляют к 100 мл буфера, содержащего 10 мМ трис- HCI (рН 7,5), 6мМ MgCl2 и 60 мМ NaCI. Затем добавляют 80 единиц Hind III и инкубируют 3 ч при 37°С с целью удаления pLI ДНК в Hind ll-области. Продукт реакции фракционируют электрофорезом на геле агарозы, после чего выделяют фрагмент ДНК примерно в 0,5 кВ, используя метод с ЕАЕ-бу- магой. Полученная ДНК является связующей ДНК с олиго (дГ) цепями (далее называемая связывающей ДНК).
Примерно 2 мкг поли (А) РНК и примерно 1,4 мкг векторной затравки, полученной указанным способом, растворяют в 22,3 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCI (рН 8,3), 8 мМ MgCb, 30 мМ KCI, 0,3 мМ ДТТ, 2 мМ дНТФ (дАТФ, ДТТФ, дГТФ и дЦТФ) и 10 единиц рибонуклеазного ингибитора. Затем добавляют 10 единиц репертэзы и инкубируют 40 мин при 37°С с цепью получения ДНК, комплементарной РНК Продукт реакции экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с выделением векторэ-затравки ДНК, связанной с двойной нитью РНК-ДНК. ДНК растворяют в 20 мл КдТ-буфера, содержащего 66 мкМ дЦТФ и 0,2 мкг поли (А). Затем добавляют четырнадцать единиц КдТ и в течение 8 мин при 37°С проводят инкубирование с присоединением к З -кольцам кДНК 12 (дЦ)-цепей. Продукт реакции подвергают экстракции смесью фенола с хлороформом и осаждению этанолом с выделением кДНК-вектора- затравки ДНК. связанной с (дЦ) цепями. Полученную ДНК растворяют в 400 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5) 6 мМ MgCl2 и 60 мМ NaCI. Добавляют 20 единиц Hind III и инкубируют 2 ч при 37°С с отсечением ДНК в Hind-lll-области. Продукт реакции экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с получением 0,5 пмоля кДНК-вектора-затравки ДНК, связанной с (дЦ) цепями. Затем 0,08 пмоля ДНК и 0,16 пмоля упомянутой связующей ДНК добавляют к 40 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5), 0,1 М NaCI и 1 мМ ЭДТА, и инкубируют при 65°С, 42°С и 0°С в течение соответственно 10, 25 и 30 мин. Реакционный раствор доводят до 400 мл (полный объем) раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5)4 мМ MgCl2, 10 мМ (, 0,1 М KCI и 0,1 мМ . К реакционному раствору добавляют 10 единиц ДНК-лигазы Escherlchla coll и инкубируют в течение 1 сут при 11°С. Реакционный раствор доводят до раствора, содержащего 40 мкМ дНТФ и 0,15 мкМ /2-НАД. Затем добавляют пять единиц ДНК-лигазы Esherlchla coll, 2 единицы рибонуклеазы Н Escherlchia coll и 7 единиц ДНК-полимеразы 1 Eschtricla coll и инкубируют сначала 1 ч при/12°С и затем еще 1 ч при 25°С. Приведенной реакцией осуществляют циклизацию рекомбинантной ДНК, содержащей кДНК, причем часть двунитевой РНК-ДНК замещается ДНК, в результате чего образуется рекомбинантная плазмида, содержащая полную двунитевую ДНК.
Пример 3. Escherichia coll 600JF8 трансформируют, используя рекомбинант- ную плазмиду, полученную в примере 2. Среди примерно 10000 колоний, полученных по этой методике, 4800 колоний закрепились на нитроцеллюлозе. Отбирают восемь штаммов, накрепко гибридизирую- щихся при 40°С с пробой, причем Д IK соответствует последовательности аминокислот от 23-ей и до 28-ой, начиная от N-конца гормона роста лосося, а именно
1 23456789 10 11 12 13 14 15 16 17
5 -AAAATGTTTAACGACTT (G)(С)CD СП
(3-е основание является А или С, 9-е - Т или С, 12-е - С или Т, 15-е - С или Т, и комбинацией указанных оснований получают 16 видов искусственных ДНК) помечают 32Р. Методом Southern подтверждают, что 8 штаммов гибридизуются с упомянутой пробой, и искусственная ДНК-проба соответствует последовательности аминокислот вокруг С-конца:
1 23456789 1011 12 13 14 15 16 17
САСAAAGTAGAGАС
(Т) (G)СП А
(G) (С)
(3-е основание является С или Г, 6-е - А или С, 9-е - А, Т, С или С, 12-е - С или А и комбинация оснований дает 32 года искусственных ДНК). Плазмиды, названные соответственно pSGHI, 3, 6, 8, 9, 10, 14 и 17 имеют ДНК-последовательность, заданную последовательностью аминокислот в известном гормоне роста лосося и, как полагают, содержат кДНК гормона роста.
Пример 4. 8 плазмид, полученных указанным способом, гидролизуют.различными эндонуклеазами, после чего определяют карты расщепления частей кДНК. Плазмиды разбивают на три группы, а именно группу pSGHI. 6, 9, 10 и 17, группу pSGH3 и группу pSGHS и 14 исходя из положения участков ограничивающей эндонуклеазы.
Полную последовательность нуклеоти- дов трансляционной области плазмид, которые хорошо гибридизуются с пробой искусственной ДНК (см, пример 3) и которые, как полагают, содержат почти полную кДНК, в особенности pSGHI, определяют по методу Sanger с использованием М13- фага. Основания под номерами 1-66 кодируют сигнальный пептид, а 67-630 кодируют зрелый полипептид гормона роста лосося.
Плазмиды pSGH8 и pSGH 14 отличаются друг от друга следующим образом, pSGH14 содержит более длинную кДНК почти полной длины. Последовательность основания в pSGH14 определяют по методу Sanger, используя М13-фаг.
Основания 1-66 кодируют сигнальный пептид, а под номерами 67-630 кодируют зрелый полипептид гормона роста лосося.
Полипептид, закодированный кДНК. полностью совпадает с полипептидом, закодированным с помощью pSGHI в 22 аминокислотах сигнального пептида, но различается 12 аминокислотами зрелого пептида из 188 аминокислот. Далее, если
речь идет о последовательности N-конце- вых 40 аминокислот, определенной в полипептидном гормоне роста лосося, то 5 аминокислот в ней явно отличны. Таким образом, считают, что кДНК, содержащаяся в pSGHH, кодирует гормон роста рыб, отличный от pSGHI.
Пример 5. 5 мкг плазмиды pSGHI, кодирующей полипептидный гормон роста
о лосося, растворяют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ Mg2Cl2 и 10 мМ NaCI (далее называемый буферным раствором У-10). Затем добавляют 10 единиц рестриктаэы Mboll и в течение
53ч при 37°С проводят реакцию гидролиза. Затем концентрацию NaCI в растворе доводят до 175 мМ, после чего добавляют 10 единиц Salt. Снова проводят реакцию гидролиза в течение 3 ч при 37°С. Методом НТГ
0 получают примерно 0,2 мкг фрагмента ДНК в 163 Ьр, соответствующего N-концевой области.
Затем 5 мкг pSGHI растворяют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН
5 7,5) 10 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCI (далее называемом буферным раствором У-100). Добавляют десять единиц Bam HI, после чего в течение 3 ч при 37°С проводят реакцию гидролиза. Затем концентрацию NaCI в ре0 акционном растворе доводят до 175 мМ и добавляют 10 единиц Sail. Снова проводят в течение 3 ч при 37°С реакцию гидролиза, методом НТГ из реакционного раствора выделяют примерно 0,5 мкг фрагмента ДНК
5 900 Ьр, содержащего С-концевую область и З -нетрансляционную область.
Отдельно растворяют в 40 мл буферного раствора У-100 5 мкг pCbLI и добавляют Ват HI и Hind III no 10 единиц каждого. ПриЗО°С
0 ° течение 3 ч проводят реакцию гидролиза, .после чего из реакционного раствора выделяют примерно 1 мкг фрагмента ДНК в 2,7 кВ, содержащего триптофановый промотор. С целью присоединения трансляцион5 ного инициирующего кодона АТГ, необходимого для экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный зрелый гормон роста лосося, и для связывания векторной ДНК и вышеупомянутой ДНК, синтезируют липидную
0 ДНК по приведенной схеме.
« и oil
/TACAAAACJ -347 per Т А Т С Т Т Т Т -ЧЧ2-ГГ ffle Glu /4/75
5
Met
Две единичные нити ДНК в 17-mer и 12-mer синтезируют обычным триэфирным методом. Затем 17-mer и 12-mer ДНК по 12 пмолей каждой растворяют в 20 мл раствора, содержащего 50 мМтрис HCI(pH 7 5)- 10
мМ MgCIa, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Добавляют шесть единиц Т4-полинук- леотидкиназы и при 37°С в течение 60 мин проводят реакцию фосфорилирования.
Затем 0,1 пмолк Mbo Il-Sal l-фрагмента (163 op) pSGHI, 0,06 пмоля Sal l-Bam Hl- фрагмента (примерно 900 op) pSGHI и 0,02 пмоля Hind Ill-Bam Н1-фрагмента(примерно 2,7 KB) pGELI, полученных вышеуказанными способами, растворяют в 30 мл раствора, содержащего 50 мМтрис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCJ2, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Затем добавляют 5 мл раствора для осуществления реакции фосфорилирования искусственной ДНК, полученного вышеприведенным способом. К полученной смеси добавляют шесть единиц Т4-ДНК-ли- газы и при 4°С в течение 18 часов проводят реакцию связывания.
Для получения Апг-колонии трансформируют E.coli HB101. Из колонии выделяют плазмиду ДНК pSGH1B2 с помощью поли- акриламидного геля и использованием ДЕАЕ-бумаги. Выделяют примерно 0,05 мкг фрагмента ДН К размером 108 ьр, соответствующего N-концевой области.
Затем 5 мкг pSCH14 растворяют в 40 мл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCl2 и 50 мМ NaCI (далее называемом буферным раствором У-50). Затем добавляют PVU II и Hind III no 10 единиц каждого и в течение 3 ч при 37°С проводят реакцию гидролиза. Методом НТГ из реакционного раствора выделяют примерно 0,5 мкг фрагмента ДНК размером 3,3 кВ, содержащего С-концевой участок и 3- нетрансля- участок гормона роста, образованного из pSGH14 и части вектора.
Для присоединения трансляционного инициирующего кодона АТГ, необходимого для экспрессии ДНК, кодирующей полипептидный зрелый гормон роста лосося и для связывания- векторной ДНК и упомянутой ДНК, синтезируют по приведенной схеме связующую ДНК.
МвоИ
С А А А С| -3 14 ir.fr С Т Т Т Г AS/t
Htnd III
5- A С С Т Т
А Т С Т А С HZl
9 тег
Две единичные нити 14-mer и 9-mer синтезируют обычным триэфирным способом. Затем 14-mer и 9-mer ДНК по 39 пмолей каждой растворяют в 20 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCI, 10мММдС12, ЮмМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Добавляют шесть Т4-полинуклеотидкиназы и в течение 60 мин при 37°С ведут реакцию фосфорилирования. Строение pSGH1B2 исследуют расщеплением с помощью ECoRI, Hind III,
Clal, Bge II, Sail, и Bam H и электрофорезом на геле агарозы. Последовательность ДНК, кодирующую N-конечную область полипептидного гормона роста лосося в pSGH1B2, устанавливают методом Sanger используя У13-фаг.
0
Hind
A JKC С Т Т Т Т С С АЧА
н 8 он
АТАСААААС ,САА Т А Т С Т Т Т ЪС Т Т
3 1е Ми /5Л 01л
подтверждают, что
Met
В результате pSGH1B2 содержит ДНК, кодирующую зрелый полипептидный гормон роста лосося. Пример 6. 1) Конструирование из
5 pSGH14 рекомбинантной плазмиды pSGH11В9, кодирующей зрелый гормон роста лосося:
5 мкг плазмиды pSGH14, кодирующей гормон роста лосося, растворяют в 100 мл
0 раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgClj и 10 мМ NaCI. Затем добавляют 10 единиц рестриктаэы Mbo II и при 37°С в течение 3 ч проводят реакцию гидролиза. Концентрацию NaCI в растворе дово5 дят до 50 мМ, после чего добавляют 10 единиц PVUII. Снова проводят в течение 3 ч при 37°С реакцию гидролиза. Из реакционного раствора электрофорезом на полиак- риламидном геле выделяют плазмидную
0 ДНК.
Затем 0,08 пмоля Mbo II-PVU И-фраг- мент (108 bp) pSGH14 и 0,02 пмоля PVU Il-Hlnd Ill-фрагмент (примерно 3,7 кв) pSGH14, растворяют в 30 мл раствора, со5 держащего 50 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитола и 1 мМ АТФ. Затем добавляют фосфорилированную синтетическую ДНК в. количестве 5 мл. К полученной смеси добавляют шесть единиц
0 14-ДНХ-лигазы и при 4°С в течение 18 ч ведут реакцию связывания
Используя- полученный реакционный раствор, трансформируют Escherichia coll НВ101, получают Amr-колонию, из которо й
5 выделяют плазмиду ДН К pSGH11B9. Строение pSGHI 1B9 устанавливают расщеплением с помощью Hind II, Xbal, Boll) и Bam HI и электрофорезом на агарозном геле.
2) На этой стадии 5 мкг pSGH 11В9 рас0 творяют в 40 мл буферного раствора У-50, после чего добавляют Bam HI и Hind III no 10 единиц каждого. Затем проводят в течение 3 ч при 37°С реакцию гидролиза. Методом HIT из реакционного раствора выделяют
5 примерно 0,1 мкг фрагмента ДНК примерно в 1200 вр, кодирующий полный полипептидный гормон роста взрослого лосося.
Отдельно растворяют 5 мкг pCELJ в 40 мл буферного раствора Y-50,после чего добавляют Bam HI и Hind III no Юединицкаждого. После проведения в течение 3 часов при 37°С реакции гидролиза из реакционного раствора методом НГТ выделяют примерно 0,1 мкг фрагмента ДНК размером 2,7 Кв, содержащего триптофановый промотор.
Затем 0,01 мкг Hind Ill-Bam HI фрагмента (примерно 1200 вр). pSG Н11В9 и 0,05 мкг Hind Ill-Bam Hl-фрагмента(примерно 2,7 Кв pCELI растворяют в 30 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотреитол и 1 мМ АТФ, после чего добавляют 6 единицТ4-ДНК-ли- газы. Реакцию связывания проводят в течение 18ч при4°С.
Используя полученный раствор, трансформируют штамм Escherlchla coll HB101, получают Am , колонию, из которой выделяют плазмиду ДНК pSGH11C2. Строение pSGH 11С2 установлено расщеплением с помощью EcoRI, Hind III, Clal, Bgl II и Bam HI и электрофорезом на агарозном геле.
Пример 7. Штамм Estchtrlchia coli N 3110 (FEPM-BP-732) трансформируют с помощью рекомбинантной плазмиды pSGH11B2 или pSGH11C2. Полученную Ат- колонию инокулируют в 8 мл питательной МЦГ-среды (рН 7,2), содержащей 0,6 % Na2P04, 3 % КН2РСч 0,5 % NaCI, 0,1 % МНдС, 0,5 % глюкозы, 0,5 % казаминокислоты, 1 мМ MgSCM и 4 мкг/мл витамина Bi и в течение 18 ч продолжают при 30°С куль1- тивирование. Бульон, содержащий культуру, центрифугируют 10 мин при скорости 8000 об/мин с выделением клеток, которые суспендируют в буфере Taemmll и подвергают действию НДС в сочетании с электрофорезом на полиакриламидном геле с окрашиванием реактивом Coomasse Brilliant голубым для обнаружения полипептидной полосы во фракции с молекулярным весом примерно 25000. В случае применения штамма Е. coli, не содержащего плазмиду, указанная полоса не наблюдается. Тем самым подтверждено, что Eschtrichla coll, несущая pSGH1 В2 или pSGH 11С2, продуцирует в больших количествах полипептидный гормон роста лосося.
Формул-а изобретения
1. Способ получения ДНК, кодирующей гормон роста лосося, заключающийся в том, что экстрагируют мРНК из гипофиза рыбы путем пропускания через колонку с олиго- (аТ)-целлюлозой, синтезируют кДНК со следующей нуклеотидной последовательностью:
Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения кДНК, кодирующей гормон роста рыбы, получение рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих данный гормон, а также способа получения полипептидного гормона роста рыб с использованием микроорганизма. Сущность изобретения; информационную РНК извлекают из гипофиза лосося, после чего синтезируют ДНК, комплементарную иРНК (кДНК). Получают пробу ДНК, соответствующую последовательности аминокислот. NIKON ца гормона роста лосося, после чего клонируют ген гормона роста лосося путем отбора кДНК, которая гибридизуется с пробой ДНК, и определяют последовательность оснований ДНК. Описана экспрессия и накопление в питательной среде гормона роста лосося в результате культивирования микроорганизма, содержащего рекомби- нантнуюплазмидную ДНК, в которую введена кДНК, кодирующая гормон роста лосося. 4 з. п. ф-лы. Ј
102030ЛО5060
ATGGGACAAGTGTTTCTGCTGATGCCAGTCTTACTGGTCOGTTGTTTCCTGAGTCAAOGG «etGlxGlnValPh«LeuLeuf1etPr-oV«1L«uLeuValSei-CyoPheLeuSerGlnBly
70ВО90100110120
GCAGCGATA3AAAACCAACGGCTCTTCAACATCGCGGTCAGTCGGG1GCAACATCTCCAC AlaAlallaGluAonGlnArgLeuPhaAsnllffAlaValSar-AroValGlnHiBLauHis
130140ISO160170180
CTATTGGCTCAGAAAAIGTTCAATGACTTTGACGGTACCDTGTTGCCTGATGAACGCAGA LauLeuAlaGlnLxin tPheAanAapFheAapGlyTK-LeuLeuP -oAapGlijAroAre
190200210220230240
CAGCTGAACAAGATATTCCTGCTGGACTTCTGTAACTCTGACTCCATCGTGAGCCCAGTC GlnLeuAsnLysl 1 aPhcLruLtuAapPheCrsAsnSerAioSer I «ValSarProVal
250260270290290300
GACAAGTACGAGACTCAGAAGAGTTCAGTCCTGAAOCTGCTCTACATTTCTTTCCOTCTO ) r-GluTbi-Glnl.)4S«rSerValL ul,. jTVrII«S«rPh Ai-0L«u
Э10320330ЗЛО350360
ATTGAATCCTGGGAGTACCCTAGCCAGACCCTGATTATCTCCAACAGCCTAATGGTCAGA IlaGluSerTrpGluTyrProSerGlnTtvLeuItelleSarAanSc -l.cuMatValAro
370380390400 410120
AACGCCAACCAGATC fCTGAGAAGC rCAGCGACCTCAAAGTGGGCATCAACCTGCTCATC AsnAl aAsnGln I U5arG1 u(yr( AsptauUysVa IG1 у I1 «AanL.uLauI1
430440450460470480
ACGGGGAGCCAGGATGGCGTACTGAGCCTGGATGACAATGACTCTCAGCAGCTGCCCCCC TbrGI rSarGlnAapGl yV« ILeuSvr-UeuAapAapAanAsoSerGl nGtnLaoProPro
« 0500310520530540
TACGGOAACTACTACCAGAACCTGGGOGGCOACGGAAACGTCAGGAGG ACTACGAOrTG TyrGlyAanTyrTyrGlnAanLeuSlyGlyAapGlyAorWalAroAr A TyrGluttu
5505605705805°0600
TTGGCATOCTTCAAGAAGG4CATGCACAAGGTCGAGACCTACCTGACCGTCCCCAAGTGC L uAlaCyiP i«LysLy A3pM.tMioLysV«ISIuT v-TyrL«uTtv-Va1Alal.yaCr
«10623630
AGGAAGTCACTCGAGGCCAACTGCACTCTGTAG A gLyaSarLauOluAl aAanCyaT v L«ufl ia
10203040SO«0
ATGGeACAACTGTTTCTGCTGATCCCACTCTTACTCGTCAGTTCTTTCCTGAGTCAAGGG MetGlyGlnValPhet.euLeuKetPcoVaLLeu.«uValSerCy Phel.cuS«rGlnGly
TO8090100110120
GCGGCGATGCAXAACCAACGGCTCTTCAACATCGTCGTCAACCGGGTGCAACACCTCCAC AlaAlaHetCluA«nClnArqLeuPheAnnIleVatValA8 r9V«lClnBUL«aHt
1)0140ISO1(0170HO
СТХТТСССТСАСААЛАТОТТСЛАССАСГГТСЛЛСССАСССТСТТСТСТСАТСМСССАНА Le4l.auMaClnl.y«HetJheAanf.jpPheCliiClyThrLeuI.euSef pCl4Ar9 tq
190200210220DO240
CActTGAACAACATATTCCTGCTGGACTTCTGTAAC-. CTCACTCCATCCTGACCCCCATC ClnkeuMi Ly llePheLeuLeuXspPheCysAsn-cierA Eb5erIlcValSccProIlc
2SO260270260290300
GACAAGCAGGAGACTCAGAAGAGITCAGTCCTCWiGCTGCTCCATATCTCTTTCCCCCTG AepLyeGlnGluThtrClnI.ysSetSerV ll.euLy LeuLeuHlaIleSetPh«Ar9L«u
310320330Э40 350360
ATTGAATCCTGGGAGTACCCTAGCCAGACCCTGACCATCTCCAACAGCCTAATGGTCACA IltCluStrTcpCluTytPreSecClnThrLeuTbcIleStrAsnSetLeuHetVaLAcq
370180390400415420
imCTCCAACCAGXTCTCTCAGAAGCTCAGCGACCTCAAAGTGGGCATCXACCTGCTCATC AinSe.cAEnGlnlleSerGluLysLeuSerAspLentjytValGlylleAanLeuLeuIle
430440450460470 BO
nAGGGGAGCCAGCAACCGGTACTGACCCTGGATGACXATGACTCTC OCATCTGCCCCCC luClySerClnGluClyValLeuScf LeuAppAapAaf apScrClnKjrLcurf oPco
490SOOS10S20S30540
lACGGGAACTACTACCACAACCTGGGGGCCCACGG -AACCTCACCf,CCA CTACCimCTG TyrGlyAinTytTytGlnA nbeuGlyGly.-.epClyAinValArgArqAanTytGluLeu
SSOS60570590590(00
TT GCCTGCTTCAACAAGGACATGCATAAGCTTCAGACCTACCTCACCCTCGCTAACTGC L«uAlaCyaPhct,yaLycAcpHttRlaLy«valCl JThcTyrLtuTh VtlAltI,yiCya
(10620630
АССААСТСАСТеСЛССССЛЛСТССЛСТСГСТАА AujbyiSatLauGluAlaAinCyaThfLeu
с использованием обратной транскрипгазы и мРНК в качестве матрицы.
с помощью ДНК-лигазы и замены РНК-части в двунитевой структуре РНК-ДНК на ДНК с помощью ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы I и рибонуклеазы II и отбирают целевую плаз- миду по способности гибридизироваться с ДНК-пробой, имеющей следующую ДНК-последовательность известного гормона роста лосося.
5 - ААА TGTTTAACGAC ТТ
(G) (С) СП
полипептида в результате расщепления плазмиды pS GH1 рестриктазами Sal I и Bam HI, далее конструируют ДНК-фрагмент с триптофановым промотором путем расщепления плазмиды pGELI рестриктазами Hind III и Bam HI, синтезируют ДНК-линкер следующей формулы
5 - AG СТТАТ ATA GAAAAC - 3
3 - ATA CTATC ТТГТ - 5
и лигируют полученные ДНК-фрагменты и ДНК-линкеры с помощью ДНК-лигазы.
5 - AG СТТАТ GG ААААС - 3
3 - АТА СС ГПТ - 5
далее лигируют полученные ДНК-фрагменты с ДНК-линкером с помощью ДНК-ли- гаэы, получают ДНК-фрагмент полного полипептида гормона роста лосося путем обработки полученной рекомбинантной плазмиды с рестриктазами Hind III и Bam HI, конструируют ДНК-фрагмемт с триптофановым промоторором путем расщепления pGE41 рекстриктазами Hind III и Bam HI и получают целевую плазмиду связыванием ДНК-фрагментов с помощью ДНК-лигазы.
5 Способ получения рекомбинантного гормона роста лосося, заключающийся в том, что культивируют штамм Escherlchia coll трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК pSGH1B2 или pSGH11C2 в питательной среде при 30°С в течение 18 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта.
Jarnuer и др. Gen. Сотр. Endocrln., 1976,30,91.
S.W. Tarmer et al. Endocrinology, 1981 108. 377.
A.F. Cook и др. Gen. Сотр. Endocrln., 1983 50. 335.
Приоритет попунктам:
| Jarmer и др | |||
| Gen Сотр | |||
| Endocrln, 1976 30.91 | |||
| S.W.Tarmer et al | |||
| Endocrinology, 1981 108, 377 | |||
| A.F.Cook и др | |||
| Gen Comp Endocrim, 1983 50, 335. |
