Способ определения метотрексата Советский патент 1990 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам определения метотрексата (дез- окси-4-амино-К -метилфолиевая кислота), и может быть использовано для идентификации данного соединения в лекарственных средствах с целью контроля их качества и количественного определения в воздухе производст- венных помещений при санитарном контроле и биологических жидкостях организма при фармакокинетических исследованиях.

Целью изобретения является повьппе- ние чувствительности и избирательности определения.

Способ осуществляют следующим образом.

К 1 мл раствора метотрексата в 0,1 н„ растворе гидроокиси натрия прибавляют 1 мл 25%-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл.5%-ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-. ). Измеряют интенсивность, флуоресценции полученного раствора относительно стандартного раствора с известным содержанием метотрексата. Зависимости интенсивности флуоресценции от количества 5%-ного раст- врра хлората калия и от количества концентрированной (35-38%-ной) соляной кислоты приведены в табл.1 и 2 соответственно.

Количества реактивов выбраны с учетом их максимальной растворимости

и длительности флуоресценции: 1 мл 25%-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 5%-ного раствора хлората калия (см,табл. 1| это коли 1ество опти- мально также с учетом количества всех остальных реактивов и для создания постоянного об ьема для проведе ния реакции г Ю мл) и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35- 38%-ной) (см.табл.2).. Использование запредельных количеств реактивов не позволяет достигнуть цели изобретения (см,табл.1 и 2).

Данные о флуоресценции родственных соединений приведены в табл.3. Данные по зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации метотрекса- та (калибровочный график) приведены в табло . Линейная зависимость между концентрацией метотрексата и интенсивностью флуоресценции наблюдается в пределах 0,001-8 мкг/мл.

Чувствительность определения со- . ставляет 0,001 мкг/мл метотрексата,

Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации метотрексата (калибровочный график) приведена в табл.4. Интенсивность флуоресценцир1 сохраняется в течение 24 ч,

Пример 1. Качественное определение метотрексата.

К крупинке порошка метотрексата или мелкоизмельченных таблеток прибавляют 1 мл 0,1 и. раствора гидро- окиси натрия, встряхивают, прибавляют 1 мл 25%-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 5%-ного раствора хлората калия. Перемешивают и добавляют 0,8 мл концентрированной соля- ной кислоты (35-38%-ной), Наблюдают ярко-голубую флуоресценцию при облучении раствора ультрафиолетовым светом с длиной волны 365 нм. Флуоресценция указывает на содержание в исследуемой пробе метотрексата,

Цример 2. Количественное определение метотрексата в крови (искусственная смесь),

К 1 мл крови, содержащей I мкг npe пар.ата, прибавляют 4 мл 0,83%-ного раствора трихлоруксусной кислоты5 перемешивают и центрифугируют 1-2 с, Затем в пробирку добавляют 30 мл насыщенного водой н-бутанола и после 10 мин смешивания центрифугируют . 30 мино

25 мл (аликвотная часть) органической фазы переносят в другую пробику, добавляют 10 мл гексана и 0,02 мл 6 к. раствора гидроксида натрия, 2,5 мл дистиллированной воды, перемешивают 5 мин и центрифугируют 3-4 мин Органическая фаза удаляется, К водной фазе прибавляют О,1 мл 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 30 мл смеси гексанхлороформ в соотношении 2:1 и смешивают в течение 10 мин с последующим центрифугированием. Органическую фазу удаляют. К водной фазе прибавляют 30 мл смеси этилового эфира - хлороформа в соотношении 3:1, Смешивают в течение 10 мин и центрифугируют. Органическую фазу удаляют,

К 1 мл (аликвотная часть) водной фазы прибавляют I мл 25%-ного раствора гидроксида аммония, 7,2 мл 5%- ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной), Измеряют интенсивность флуоресценции исследуемого, стандартного и контрольного растворов на элек трофлуориметре ЗФ-3,МА. Концентра- цизо метотрексата в крови (X) в мкг/мл вычисляют по формуле

X .с,з 5 п - п„

где п - интенсивность флуоресценции

исследуемого раствора; п - интенсивность флуоресценции

стандартного раствора; п - интенсивность флуоресценции

контрольного раствора; С - концентрация стандартного раствора метотрексата, мкг/мл;

3,5 - коэффициент разведения. Приготовление стандартного раствора,

50 мг метотрексата (.тачная навеска) переносят в мерную колбу на 50мл, прибавляют 0,1 н, раствор гидроксида натрия, растворяют, доводят объем до метки, 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу на 2000 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Концентрация раствора 0,5 мкг/мл.

1 мл полученного раствора переносят в пробирку, добавляют 1 мл 25%- ного раствора гидроксида аммония, 7,2 мл 5%-ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной), Концентрация раствора 0,05 мкг/мл.

5 . -1 Результаты определения приведены в табл.6,

Пример 3, Количественное определение метотрексата в моче (искусственная смесь).

К 1 мл мочи содержащей 10 мкг препарата, прибавляют 4 мл Oj83%-Ho- го раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугирзлют 1-2 с. Затем в эту пробирку добавляют 30 мл насыщенного водой н-бута нола и после 10 мин смешивания центрифугируют 30 мин,

25 мл (аликвотная часть) органической фазы переносят в другую пробирку и добавляют 10 мл гексана и 0,002 мл 6 и. раствора гидроксида натрия, 2,5 мл дистиллированной зоды перемешивают 5мин и центрифугируют, 3-4 мин. Органическая фаза удаляется, К водной фазе прибавляют О,I мл 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и 30 мл смеси гексан хлоро форм в соотношении 2:1 и смешивают в течение 10 мин с последующим центрифугированием. Органическую фазу удаляюто К водной фазе прибавляют 30 мл смеси этилового эфира - хло- роформа в соотношении 3:1, Смешивают в течение 10 мин и центрифугируют. Органическую фазу удаляют.

К 1 мл (аликвотная часть) водной фазы прибавляют I мл 25%-ного раствора гидроксида аммония, 7,2 мл 5%- ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной), Измеряют интенсивность флуоресценции исследуемого, стандартного и контрольного растворов на электрофлуориметре ЭФ-3 МЛ, Концентрацию метотрексата в биологической жидкости (X) в мкг/мл вычисляют по формуле

.С 3,5,

е П( - интенсивность флуоресценции

исследуемого раствораj П(, - интенсивность флуоресценции

Контрольного раствора; п - интенсивность флуоресценции

стандартного раствора; С - концентрация стандартного раствора метотрексата, мкг/мл; 3,5 - коэффициент разведения.

Для определения используется стан- дартньп раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл.

Результаты определения приведены в табл,7,

В табл,8 приведена зависимость ин- тенсивнлсти флуоресценции от соотношения используемых реактивов,

Пример 4, Количественное определение метотрексата в воздухе рабочей зоны промышленных предприятий „

, Исследуемый воздух со скоростью 2 л/мин в течение 10 мин просасьша- ют через два последовательно соединенных поглотительных прибора Зайцева, содержащих по 5 мл О,1 н, раствора пщроокиСи натрия.

Содержимое поглотительных приборов объединяют, мл полученного раствора переносят в пробирку, добавляют 1 мл 25%-ного раствора гидроокиси аммония, 7,2 мл 5%-ного раствора хлората калия и 0,8 мл концентрированной соляной кислоты (35-38%-ной), Измеряют интен- :сивность флуоресценции исследуемого, стандартного и контрольного растворов.

Концентрацию метотрексата в воздухе рабочей зоны (X) в мг/мл вычисляют по формуле

у -

А;В С -Y

ст

где А - количество метотрексата, най -- денное в анализируемом объеме 1 мл поглотительного раствора, мкг;

В - объем поглотительного раствора, мл;

С - объем поглотительного раствора, взятого для анализа,: мл;

Yp - объем воздуха, отобранного для анализаJ приведенный к стандартным условиям. Количество метотрексата в анализируемом объеме 1 мл поглотительного раствора А в мкг вычисляют по формуе

П По J

А - ------ а,

П - По

де d - количество метотрексата в

стандартном растворе, взя-| том для проведения реакции (i мл), мкг;

п - показания флуориметра для исследуемого раствора;

n - показания флуориметра для

стандартного раствора; п - показания флуориметра для

контрольного раствора. При больших концентрациях метотрек- сата в воздухе исследуемый раствор подвергают разбавлению и расчет концентрации метотрексата X вычисляют с учетом разведения, .. |g

По сравнению с известным, описываемый способ в IО раз более чувствителен и1 обладает более высокой избирательностью.

Таблица 1

Интенсивность флуоресценции, %

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению метотрексата (дезокси-4-амино N -метилфслиевая кислота), и может быть использовано для идентификации данного соединения в лекарственных средствах. Цель - повышение чувствительности и избирательности определения. Определение метотрексата ведут обработкой раствора анализируемого вещества химическими реагентами (ХР) с последующим измерением интенсивности флуоресценции полученного раствора. Обработку проводят ХР последовательно 25%-ным раствором гидроксида аммония, 5%-нь м раствором хлората ;калия и концентрированной НС1 при их объемном соотношении 1:1:(7-8):(0,8- 0,9). Способ в 10 раз более чувствителен и обладает более высокой избирательностью. 8 табл.

Формула изобретения

Способ определения метотрексата путем обработки раствора анализируемого вещества химическими реагентами с последзпощим измерением интенсивности флуоресценции полученного раствора, о.т-личающийс я тем, что, с целью повышения чувствитель - ности и избирательности определения, обработку проводят последовательно 25%-ным раствором гидроксида аммония, 5%-ным раствором хлората калия и концентрированной соляной кислотой при Объемном соотношении анализируе мой пробБ1| 25%-ного раствора гидроксида аммония, 5%-ного раствора хлората кйлия и концентрированной соля- ной кислоты 1:1:(7-8):(0,8-0,9) соответственно

Фиолетовая флуоресцейция

Флуоресценции

нет

„м..

.

Таблица2

Таблица 3

Нет флуоресценции

Флуор есценции нет

и„

«.

(

Концентрация метотрексата, мкг/мл

Время, ч

Ш

Т а б л и Т), а 4

Интенсивность флуоресценц ш, %

Таблица 5

Интенсивность флуоресценции, %

Таблица 6

Таблица

n

Интенсивность флуоресценции, %, при содержании препарата в 1 мл раствора, мкг

0,001 То,О 1 0,1 I 0,1 8,0

0,5:7,7:0,8 1,0:7,2:0,8 1,0:7,1:0,9 1,0:6,9:1,1 1,2:7,2:0,6

1438421

12 Таблицав

5

90 90

8 42

6

92 92 12 42

5

92 90 10 40