Способ выделения 6-0-галлоил-1,3-0-гексагидроксидифеноил- @ -Д-глюкозы Советский патент 1988 года по МПК C07H13/02 A61K31/7024 A61P31/16 A61P31/22 

Изобретение касается производных Сахаров, в частности способа выделения 6-0-галлоил-1,3-0-гексагидро- ксвдифеноил-,-1 -глюкозы (гипорамни- на)} обладающей противовирусной активностью, и может быть использовано в фармацевтике. Цель - создание нового способа вьщеления нового природного соединения. Для получения целевого соединения листья облепихи крушиновидной экстрагируют 40-60%- ным водным этанолом и экстракт упаривают. Остаток обрабатывают и СНС1д, упаривают водную фазу досуха и хроматографируют -на тойоперле HW-40 с последовательным использованием в качестве элюента смеси этанола с CHClj, этанола, ацетона, 50%-ного водного ацетона. Последнюю фракцию, содержащую таннины, вьщеляют, упаривают ее досуха и остаток растворяют в воде, примеси осаждают этанолом и фильтруют. Маточник упаривают досуха, остаток растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом, водную фазу упаривают и остаток хроматографируют на сефадексе LH-20 с последовательным использованием в качестве элюента 96, 90 и 30%-ного этанола. Целевой продукт получают упариванием последней фракции. Новое соединение в 20 раз активней эугениина в отношении вируса герпеса, кроме того, оно обладает активностью в отношении вируса rpimna, что отсутствует у эугениина. 3 табл. ю (Л с 00 fO

обладающего противовирусным действием, и может быть использовано в фармацевтике.

Цель изобретения - разработка нового способа вьзделения нового при- родного соединения группы гидролизу- емых таннинов.

Цель достигается выделением ri-шо- рамнина из измельченных листьев облепихи крушиновидной (Hippophae rham- noides L.) .семейства лоховых (Elaedgm ceae) совокупностью операций экстракции, осаждения и хроматографии.

Пример 1. Юг измельченных листьев облепихи крзппиновидной. заливают 100 мл 60%-ного этилового спирта, через 1 ч экстракт сливают. Таким образом проводят еще 2 экстракции. Экстракты объединяют, этипо- вьй спирт отгоняют, к остатку добавляют 20 мл воды и 5 раз обрабатьшают хлороформрм в соотношении 10:2. Водный остаток упаривают досуха и хро- матографируют на колонке с тойопер- лом HW-40 в соотношении 1 г: 7 (диаметр 2,0 см, высота 8,7 см),Элю- ируют смесью этанола с хлороформом 1:2 (400 мл) и 1:1 (450 мл). Полученные 850 мл элюата, содержащего флавоноиды,отбрасьюают, затем колонку промывают еще 100 мл этанола (минорные таннины) и 400 мл ацетона (минорные таннины). Завершают элюированиб колонки 50%-ным водным ацетоном. 3jm- ирование ведут под давлением 1,1- 1,2 атм. Первые 50 мл элюата отбрасывают, последующие 130 мл 50%-ного водного ацетона содержат таннины, в т.ч. гипорамнин.

0

5

0

5

0

5

0

5

Упаренную водно-ацетоновую фракцию (О,86 г) растворяют в 4 мл воды, приливают 30 мл 96%-ного этилового спирта, вьтавший осадок отфильтровывают, промьтают 5 мл 96%- ного этилового спирта, отбрасывают водно- э танольный маточный раствор, упаривают, растворяют в 4 мл воды, отрабатывают этштацетатом (5 мл-4), водную фазу упаривают (0,3683 г) и остаток хроматографируют одновременно на 7 колонках с сефадексом LH-20 (по 0,052 г смеси таннинов на каждой колонке, диаметр колонки 1,4 см, высота 5,5 см). Каждую колонку промывают 50 мл 96%-ного этанола и 25 мл 90%-ного водного этанола, завершают элюирование 50 мл 30%-ного водного этанола. Последнюю фракцию упаривают, получают 0,2576 г гипорамнина (2,57% на воздушно-сухое сырье), светло- коричневый порошок,(1+ 41 (с 0,40, метанол).

ИК-спектр (вазелиновое масло) т, 1600, 1720 (с OJ 3100-3600 (ОН).

Под действием разбавленной минеральной кислоты гипорамнин гидро- лизуется с образованием глюкозы, галловой и эллаговой кислот (1:1:1).

Место присоединения галлоильной (7,12 М.Д., С, 2Н) и гексагидрокси дифеноильной (6,50 и 6,78 м.д., син- глеты, 1Н) групп, а также конфор- мация углеводородного цикла (2 В) определяются данными Н-5ГМР-спектра.

В таблице приведены данные хим- сдвигов (, и констант взаимодейстБИЯ

,-,|-.l

протонов в глюкопиранозном фрагменте гипорамнина.

Чистоту полученного соединения устанавливают методом ТСХ на пластин

ках с целлюлозой Filtrak в систем .бутанол; уксусная кислота; вода 20:5:9, проявляют спиртовым раствором FeClj .

Пример 2. Экстракцию 10 г измельченных листьев облепихи проводят аналогично с тем отличием, что высушенную водно-ацетоновую фракцию (0,86 г) хроматографируют на колонке с тойоперлом HW-40 в соотношении 1г:8 см , далее процесс осуществляют по примеру .. Выход целевого продукта 0,2570 г (2,57% от массы воздушно-сухого-сырья).

Пример 3. Экстракцию 1 О г измельченных листьев облепихи проводят аналогзачно примеру 1 с тем отличием, что высушенную водную фракцию хроматографируют на колонке с тойоперлом в соотнсшении 1г; :6 см . Далее пропесс осуществляют по примеру 1. Выход целевого продукта 0,2560 г (2,56% от массь воздушно-сухого сырья).

П р-и м е р 4. Процесс осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что высупшнную водно-ацетоновую фракцию хроматографируют на колонке с сефадексом LH-20 в соотношении 0,01 г:1см-. Выход целевог продукта 0,2560хГ (.2,56% от массы, воздушно-сухого сырья)/

П р и. м е р 5. Процесс осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что водно-ацетоновую фракцию хроматографируют на колонке с сефадексом в соотношении 0,01 г: :2 см. Выход целевого продукта 0,2560 г (2,56% от массы воздушно- сухого сырья).

Пример 6. Процесс осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что экстракцию ведут 50%- ршм этиловым спиртом. Выход целевого продукта 0,2570 г (2,57% от . массы воздушно-сухого сырья).

Пример 7. Процесс осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что экстракцию ведут 40%- этиловым спиртом. Выход целевого продукта 0,2561 г (2,56% от массы Боэдушно-сухого сырья).

39 О ,

5

10

15

25

30

35

40

45

50

55

Пример 8. Процесс ос лцест- вляют аналогично примеру 1 , -но экс-.т- ракцию ведут 10%-ным эти.повым спиртом. Выход целевого продукта О, 1 044 г (1,044% от массы воздушно-сухого сырья),

Пример 10. Процесс осущес-7 - вля от аналогично Т1рпмеру , но экст- ракнию ведут 80%-ным этиловы -: спиртом. Выход целевого продукта О,)707 г (1,71% от массы воздушно-сухого сырья } .

П р и м е р 11. Процесс осу1цест- вляют аналог ; чно примеру , но экст- ракщпо ведут этиловым спиртом. Выход целепого про,о кта 0,0490 г (0,49/: fv - ;к:сы 1 Озду нт;о-сухого ) .

ilcCJieaOiia npOTHBOBiipyCHOji ; Ктизпости гипораь нина в отношении ;:i руса герпеса. Изучение-вируслнгибп- руюиего цеГ1ствия rtsnopaMHHHa п .гць:.-- liieisHi вируса герпеса 1 типа . Ij, проводят в перви 1нотрипспии; 1;- рор4пно11 культуре клеток фибр1- бл ТР73 э: ;бриона (ФЭК).

. BiipyccoAepKaiiiyio жтадкосгь ь оСгьс-i-:;/ 1 i.ri с conepKuiiineM вируса 1 , 10, 0(; и 1000 Т11Л /мл наносят на мопосло;; культуры клеток куриных фиброоластот, д.п,ч контакта вируса с клеткой. Через 1 ч удаляют остатки вируса и во флаконы вносят среду без сыворотки V контроль размножения вируса). В oi .ij ные флаконы вносят среду без сыворотки с растворршой в ней макс1 1ально пepeнocи юй концентрацией гипopa ии- на5 не обладающей цитотоксическим действием на клетки. Учет снь;та проводят по наступлению цитопатогенного действия как в опытных, так и в копт-рольных флаконах после инкубпрова-- ния в термостате при 37 С в течение 3-5 дн.

Данные из 1ения вирусингибируюиси активности гипорамнина в отношении вируса герпеса приведены в табл. 2

В результате проведенных исследо- ваний установлено (табл. 2), -что гипорамнин в концентрации 0,5мкг/мл ингибируют 1 О ТЦД р вируса герпеса типа Л ,,

Исследование противовирусной ак-- тивности гипорамнина в отношении вируса гриппа. Вируснейтралиэуюиее действие гипорамнина изучают в оти г-- шении вируса rpi-mna штамм А Англия в контактных опытах in Titro с тяш.н- кацией на куриных эмбрионах.

5 ,

Гипорамнин растворяют в буферном растворе с рН 7,2-7,4 в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 мкг/мл и смешивают с различными количествами эмбриональных инфекционных доз , 10, ТОО и 1000 ЭЙД,до вируса гриппа, Смеси препарата с вирусом выдерживают в течение 1 ч при 14 С, после чего вводят по 0,2 мл в аллантоис- ную полость 9-10- дневных интактньк куриных эмбрионов. Через.48 ч куриные эмбрионы вскрьшают и в алланто- исной жидкости определяют наличие вируса методом реакции гемагглю- тинации. Активность препарата выражают количеством нейтрализованных эмбриональных инфекционных доз вируса ,

Данные из1учения вируснейтрализ /то- щей активности гипорамнина в.отношении вируса гриппа штамм А Англия приведены в табл. 3.

В результате проведенньк исследований установлено (табл. 3), что гипорамнин обладает высокой активностью в отношении вируса гриппа штамм А Англия: концентрации 100 и 1000 мкг/мл гипорамнин ингибиругот 1000 (эмбриональные инфекционные дозы) вируса гриппа и концентрации 10 мкг/мл гипорамнин ин- гибируют 10 ЭЙД р вируса гриппа.

Сравнение полученных данных по противовирусной активности гипорамнина и известных данных по эугени- ину (близкой по структуре эллаготан- нин из Syzygium aromatica) позволяет установить, что гипорамнин (ин- гибирующая концентрация 0,5 мкг/мл )

39107 6

в 20 раз более активен, чем эугениин (ингибиру ощая концентрация 10 мкг/мл) в отношении вируса герпеса. Кроме J. того, для гипорамнина установлена также вируснейтрализующая активность в отношении вируса гриппа, осутст- вующая у эугениина.

Таким образом, предлагаемое ве- 10 щество, выделенное из природного сырья, - гипорамнин, обладает высокой противовирусной активностью.

Формула изобретения

15 Способ выделения 6-0-галлаил-1,3 -0-гeкcaгидpoкcидифeнoил -D-глlo- кoзы, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, лиртья облепихи крушиновидной (Hippophae rhamnoides L.) экстраги20 ругат 40-60%-кым. воднр гм этштовьп спиртом, остаток после упаривания обрабатывают водой и хлороформом, Боднуто фазу упаривают.досуха, хроматографи- руют на тойоперле HW-40 с использо-

25 ванием в качестве элюепта последовательно смеси этилового спирта и хлороформа, этанола, ацетона, 50%-ного водного ацетона, выделяя последнюю фракцию, содержащую таннины, упари30 вают досуха, растворяют в водв; примеси осаждают этанолом, маточник после фильтрации упаривают досуха,растворяют в воде, экстрагиру от этилаце- татом, остаток после упаривания вод3g ной фазы хроматографируют на сефа- дексе LH-20 с использованием, в качестве элюента этилового спирта последовательно 96%, 90%, 30%, получая целевой продукт упариванием послед40 ней фракции.

Таблиц

Таблица 2

Вещество I Активная концентрация. Активность L

Гипорамнин 0,5Полностью кнгибирует репродукцию вируса в дозе 10 ТЦЦ дд в первично- трипсинизированной культуре клеток ФЭК

Эугениин , 10,0Тормозит репродукцию внруса в перевиваемых эпи- телиоидных клетках

Таблица 3

Вещество Концентрация препарата, Количество ,нейтралимкг/млзующих ЗИД вируса

Гипорамнин 10001000

1 001 000

1010

1Н/а

ЭугениинДанные обактивности в литературе отсутстуют