Штамм бактерий BacILLUS меGатеRIUм - продуцент рестриктазы Вме 361 I Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GGCC.

Цель изобретения - получение .нового штамма Bacillus megaterium ВКПМ В-4723 (361), нетребовательного к питательным средам и синтезирующего рестриктазу, способную узнавать и цасщеплять последовательность нукле- дтидов GGCC, с высоким выходом.

Штамм Bacillus megaterium 361 , выделен из почвы в, результате поиска штаммов-продуцентов рестриктаз среди почвенных бактерий.

Штамм В. megaterium 361 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки неподвижны, грамположительные, палочковидные, соединены в длинные нити, в старой культуре возможны вздутые неправильные формы, палочковидные клетки с веретенообразными концами. Размеры клеток 1,2-1,4x2,8-10,0 мкм. Споры не превышают диаметр клетки, эллиптические, расположеннефазнообраз- ное (центральное, эксцентральное, терминальное).

Культуральные и физиологические признаки.

00

Метаболизм дыхательный. Реакции на катапазу, амилазу, желатиназу, фенилаланиндегидролазу и Фогес-Про- скауэра положительны. Штамм восстанавливает нитраты, не вьщеляет индол, растет на среде с добавлением 7% NaCl, вьщеляет кислоту и газ на глюкозе, растет при рН 5,7, параспоральные тельца не обнаруживаются, наблюдаются неокрашенные глобулы. Максимальная температура роста штамма 35-40 С, минимальная 3-20°С, рост при 50 С отсутствует. Тест на лецитиназу, тира- зиназу - отрицателен, при 0,001% лизоцима не растет.

Штамм хранится в 15%-ном глицерине в L-бульоне при минус 60 С и в лио- фильно-высушенном состоянии.

На РПА (рыбопитательный агар) образует непрозрачные, белесые колонии, .блестящие, со временем шероховатые, |край ровный. На РПБ рыбопитательный (бульон образует пленку, муть, осадок.

Продуцируемая предлагаемым штаммом рестриктаза характеризуется следующими свойствами.

Узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов GGCC; оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7.,5-9,0; оптимальная температура действия 37°С; для активности рестриктазы требуются ионы Mg с оптимальной концентрацией 5-10 мМ; оптимальная концентрация NaCl 0-50 мМ.

Для культивирования B.megaterium 361 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды:

10

5 10

Культивирование проводят при 30 С с хорошей аэрацией в течение 24 ч.

Выход биомассы составляет 10,0 г на 1 л среды.

Выход рестриктазы составляет 1 млн.ед.акт. на 1 г биомассы.

Преимущества предлагаемого штамма Bacillus mega te-rium 361 по сравнению с известным показаны в таблице. ,

Как видно из таблицы B.megaterium .менее-требователен к составу питатель- . ной среды, выход биомассы этого штамма с 1 л среды как минимум в 5 раз больше, чем выход биомассы В.sphaeri- cus. Выход рестриктазы с 1 л культу0

5

0

5

0

5

0

5

д

ры B.megaterium в 10 раз выше, чем с 1 л культуры В. sphaericus.,

Пример. Клетки B.megaterium 361, хранящиеся в 15%-ном глицерине в L-бульоне при минус , размораживают и высевают для оживления в L-бульон, инкубируют 24 ч при 30°С. Полученную жидкую культуру высевают на чашки РПА для получения отдельных колоний, инкубируют 24 ч при 30°С. Выращенную на плотной среде культуру проверяют на чистоту и засевают ею 50 мл L-бульона для получения инокулята, выращивают 18 ч при 30 С. Полученным инокулятом (ОП 3,6) засевают колбы с 250 мл LB с 1% глюкозы, выращивают 24 ч (ОП 3,8). После охлаждения клетки собирают центрифугированием. Выход биомассы 10 г сырого веса с 1 л среды.

0,5 г клеток суспендируют в 10 мл буфера 0,1 М трис-HCl, рН 8,0, содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% тритон Х-100, 1 мг/мл лизоцима, в течение 20 мин при 0°С. Затем суспензию озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием при 18000 об/мин в течение 40 мин при Ј°С и надосадоч- ную жидкость, содержащую 500000 ед. акт.рестриктазы, наносят на колонку (1x5 см) с фосфоцеллюлозой Р11 уравновешенной буфером А (10 мМ калий- фосфат, рН 7,4, 10 мМ 2-меркаптоэтанол) . Затем колонку промывают 5 мл буфера А и сорбированные белки элю- |ируют градиентом концентрации NaCl от 0 до 1 М в буфере А, общий объем градиента 20 мл. Собирают фракции объемом 1 мл. Фракции, содержащие активность рестриктазы (обычно элю- ирующиеся при 0,5-0,75 М NaCl), объединяют, диализуют в течение 3 ч против 200 мл буфера А. Отдиализован- ную фракцию наносят на колонку (объемом 1 мл) с гидроксилапатитом, уравновешенным буфером А, промывают 2 мл буфера А. Сорбированные белки элюиру- ют градиентом концентрации калийфос- фата от 0,01 до 0,8 М. Общий объем градиента 10 мл, собирают фракции по 0,5 мл, анализируют каждую фракцию на содержание рестриктазы. Фракции, содержащие фермент, обычно элю- ирующиеся при концентрации соли 0,4- 0,78 М,собирают и диализуют против буфера А, содержащего 50%-ный глицерин. Полученный препарат фермента

516

(1 мл) имеет концентрацию 500000 ед. акт./мл. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расЛ в течение

щепления 1 мкг ДНК фага 1 ч при 37°С. Ферментный препарат хранится при минус 20°С. Из 0,5 г получают 500000 ед.акт. рестриктазы Вте 361 I.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Вте 361 I, проводят гидролиз ДНК фага ft рестриктазами Вте 361,1 BspR, Нае III по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами. Полное совпадение фрагментов, полученных при гидролизе рестриктазами Вте 361 I и BspR I, Нае III порознь и совместно указывает на то, что ре- стриктаза Вте 361 I является изоши- зомером рестриктаз BspR I .и Нае III, узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов GGCC.

Полученный штамм обладает также следующими преимуществами по сравне --- нию с известным: штамм не патогенен для человека; не требователен к питательным средам, хорошо растет, обеспечивая высокий выход культуры с 1 л среды, в 5 раз больший, чем известный штамм; обеспечивает повышенный выход целевого продукта, составляющий 1000000 ед.акт./мл биомассы . (в 2 раза больше, чем в известном). I

Поскольку рестриктаза Вте 361 I имеет сайт уз навания GGCC идентичный сайту узнаваний BspR I и Нае III, она может заменить фермент и во всех генноинженерных работах.

5

2оФормула изобретения

Штамм бактерий Bacillus megate- rium ВКПМ В-4723 - продуцент рестриктазы Вте 361 I.

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии. Целью изобретения является получение нового штамма Bacillus megaterium ВКПМ В-4723(361), синтезирующего рестриктазу Вте 361 1с повышенным выходом. Штамм выделен из почвы в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди почвенных бактерий, нетребователен к питательным средам, не патогенен для человека, позволяет повысить выход рестриктазь Вте 361 I, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидон GGCC, в 10 раз с 1 л культуры. Ытамм обеспечивает повышенный выход рестриктазы, составляющей 100000 ед./г биомассы. Для культивирования В. megaterium 361 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды: пептон 10; дрожжевой экстракт 5, NaCl 10. Культивирование проводят при температуре 30°С с хорошей аэрацией в течение 24 ч. 1 табл. а 8

Зависимость выхода биомассы {г/л) и рестриктазы (ед.акт./л) B.megaterium и B.sphaericus от состава питательной среды