Способ определения чувствительности замедленного типа к микробам Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

tsp

QD

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к аллергологии и иммунологии.

Цель изобретения - повышение точ- ности способа и сокращение сроков анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

Из лимфоидных органов и периОери- ческой крови сенсибилизированных морских свинок получают чистые суспензи лимфоцитов. Тимус и селезенку или лимфоузлы (выборочно) гомогенизируют, фильтруют через двойной слой кап роновой сетки. Лимфоциты периферической крови вьщеляют в градиенте плотности фиколл-верографин, (плотность 1,077 г/мп). Затем суспензии лимфоцитов дважды отмывают средой 199, доводят концентрацию до 2-107мл Соединяют равные объемы лимфоцитов и эритроцитов кролика в концентрации 100x10 /мл (маркер Т-клеток морской свинки), инкубируют 5-10 мин при

, центрифугируют 5 мин при 20 С, вьдерживают при 4°С 1 ч, после чего |учитьшают результат реакции. Дпя это то осадок ресуспендируют, каплю смеси помещают в счетную камеру и в световом микроскопе с увеличением х200 подсчитывают число розеток (лимфоцит с 3 и более прикрепленными эритроцитами) на 100 лимфоцитов.

Дпя диагностики повьппенной чув- ствительности замедленного типа (ПЧЗТ) достаточно определить количество Т-клеток в тимусе и в одном из периферических лимфоидных органов: селезенке, лимфоузлах или крови.

Пример 1. Морских свинок сенсибилизируют введением 5 млрд микробных клеток в смеси с неполным адъю- вантом Фрейнда в подушечки задних ла Сенсибилизацию морских свинок осуще- ствляют введением следуюк их микроорганизмов: В-гемолитического стрепткокка группы А; золотистого эпидер- мального и сапрофитического стафилококков. На высоте сенсибилизации (через 4-5 недель)определяют количество Т-клеток в лимфоидных органах и крови, ставят кожно-аллергические реакции замедленного типа и реакции торможения ьшграции лейкоцитов

(РТМЛ) .

Дополнительно проводят общепринятые кожно-аллергические реакции замедленного типа на внутрикожное вве

0

0

5 0

д е

0

дение специфических аллергенов и реакцию торможения миграции лейкоцитов по известному способу под действием соответствующих аллергенов, которые были положительными при учете через 24 ч у животных, сенсибилизированных всеми используемыми в опытах микроорганизмами. Т.е. по данным этих тестов у животных всех групп индуцировалась ПЧЗТ. При использовании же предлагаемого способа статически значимое снижение количества Т-клеток в тимусе и повышение их числа в селезенке, лимфоузлах и крови наблюдалось только у морских свинок, сенсибилизированных стрептококком гемолитическим и стафилококком золотистым.

Для подтверждения достоверности результатов, полученных по предлагаемому способу, было проведено гисто- морфологическое и гистохимическое исследования на наличие ПЧЗТ в исследованных группах животных. По данным гистоморфологии, ПЧЗТ формировалась только у животных, сенсибилизированных В-гемолитическим стрептококком и золотистым стафилококком. Мор- фофункциональные изменения у морских свинок этих групп характеризовались систем11ыми; стереотипными реакциями сосудов преимущественно венозного типа, активацией клеток соединительной ткани и появлением однородных моно- нуклеарных инфильтратов. Типична картина деструктивного эндоваскулита, некротизирующего мезеваскулита и продуктивного периваскулита, формиро-- вание которого обусловлено муфтооб- разными скоплениями сенсибилизированных Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов. Кроме того, реакция ПЧЗТ документируется иммуноморфологичес- кими перестройками в лимфоидной системе с активацией клеток зон - представителей Т-лимфоцитов и высокой их пролиферацией, а также повышенной миграцией через посткапиллярные ве- нулы, в связи с чем имелись очаги делимфатизации. У морских спинок, сенсибилизированных эпидермальным и сапрофитическим стафилококками, не выявлено морфологических изменений, характерных для ПЧЗТ. У этих животных установлены сосудисто- воспалительные изменения во всех органах. В очагах воспаления вокруг сосудов и в строме формировались инфильтраты из

полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) и макрофагов, отражающие выраженност воспалительного процесса, В лимфоид- ной системе обнаруживалась картина невьфаженных тимусзависимых и тимус- независимых зон, среди клеток в которых имелись ПМЯЛ. Через высокий эндотелий посткапиллярных венул мигрировали ПМЯЛ и лимфоциты. С использованием предлагаемого способа анализ осуществляют в течение 2-3 ч, в то же время по известному затрачивается 18-24 ч.

Упрощение способа по сравнению с известным заключается в том, что исключается этап инкубации выделенньк лимфоцитов с исследуемым микробом.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики ПЧЗТ по наличию совокупности признаков - снижению числа Т- лимфоцитов в тимусе и повышению в одном из периферических лимфоидных органов или крови - достоверно коррели- рует с результатами гистоморфологи

8

ческого исследования в отличие от кожных проб и РТМЛ и позволяет проводить диагностику ПЧЗТ эффективно, быстро и относительно просто.

Формула изобретения

Способ определения чувствительности замедленного типа к микробам, включающий сенсибилизацию животных исследуемыми микробами, забор крови, вьщеление лейкоцитов с последующим иммунологическим исследованием, о т- личающийся тем, что, с целью сокращения сроков анализа и упрощения способа, у животного дополнительно вьщеляют лейкоциты из тимуса, селезенки, или пахового, или шейного лимфоузлов, определяют уровень Т-лим- фоцитов в реакции розеткообразования и по снижению количества Т-лимфоцитов в тимусе и по повьшению их числа в селезенке или в лимфоузлах, или в крови определяют наличие чувствительности замедленного типа.

Изобретение относится к медицине, касается аллергологии и иммунологии. С целью повышения точности способа и сокращения сроков проведения анализа из лимфоидных органов и периферической крови сенсибилизированных морских свинок получают суспензии лимфоцитов, дважды отмывают их в среде 199 и доводят концентрацию до 2-10 /мл. Соединяют равные объемы лимфоцитов и эритроцитов кролика в концентрации lOO-10VMn (маркер Т- клеток морской свинки), инкубируют 5-10 мин при 37°С, 5 мин центрифугируют при 20°С, вьщерживают 1 ч при и учитывают результаты реакции. Дня этого осадок ресуспендируют, каплю смеси помещают в счетную камеру и под световым микроскопом с увеличением х200 подсчитывают число розе- g ток (лимфоцит с 3 и более прикрепленными эритроцитами) на 100 лимфоцитов(. (Л