Способ определения кальция в биологической жидкости Советский патент 1988 года по МПК G01N33/04 

Од СП

О) 4

Изобретение относится к облдсти биологии и медицины, в частности к способам исследования биологических жидкостей, преимущественно состава женского молока.

Цель изобретения - повышение точности определения кальция в биологической жидкости, преимущественно в женском грудном молоке,

Предлагаемый способ позволяет работать с минимальными количествами проб, 4 f o крайне важно при клинических исследованиях состава грудного женского молока. Кроме того, повышение точности при неизменном состава и количественной стороне реактивов известного способа обусловлено адаптацией к этим количествам граничных значений количеств бутилового и изобутипового спирта, что обеспечивает исчезновение мутности, вызываемой присутствием сложных липопротеидных комплексов, и следовательно,, снижение значений оптичес- кой плотности.

Способ осуществляют следующим образом.

В чистую сухую пробирку вносят 1,0 мл дистиллированной воды, 0,02мя разведенного в tO раз молока и 0,5 мл раствора гидроокиси натрия с концентрацией ее 0,4 моль/л. Раствор перемешивают и через 5-10 мин добавляют 2,0 мл О,1%-ного раствора глиоксаль- -бис-(2-оксианнла) в метаноле, снова перемешивают и через 5 мин добавляют 1,75-1,80 мл бутилового или изо- бутилового спирта. Добавление бутило

вого или изобутилового спирта через

5 мин обусловлено тем, что за это время заканчивается образование цветного комплекса кальция с глиоксаль-бис- -(2-оксианилом), что следует из инструкции к набору реактива и подтверж дается, данными табл.4. Параллельно, так же как и пробу исследуемой биологической жидкости, например молока, обрабатывают эталонньш раствор кальция и раствор сравнения, в Которых соответственно вместо 0,02 мл молока берут 0,02 мл эталонного раствора кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л и 0,02 мл днстиллиро- ванной воды.

Все пробы перемешивают и измеряют оптическую плотность исследуемой и эталонной проб против раствора сравнения. Измерения проводят в кюветб

(1 см) при длине волны 530-540 нм,не позднее 15 мин от момента добавления глиоксаль-бис-(2-оксианила).

Содержание кальция в молокеj ммоль/л, рассчитьшают по формуле

Х.|-2,5

10,

д

5

0

,

5

где X - содержание кальций в исследуемом молоке, ММОЛЬ/Л; А - оптическая плотность опытной пробы

Б - оптическая плотность эталонной пробы;

2,5 концентрация кальция в эталонной пробе, ммоль/л 10 - степень разведения исследуемого молока.

Повышение точности определения кальция согласно предлагаемому способу по сравнению с известным подтверждается данными, представленными в табл.1 (5 параллельных определений одной и той же пробы молока). .

Сравни-рельный анализ результатов статистической обработки величины оптической плотности цветногб продукта реакции при определении кальция по предлагаемому способу и известному показьтает, что в первом случае величины средней ошибки средней арифметической (га) и среднеквадратичес- кого отклонения (6) значительно ниже, чем при определении кальция по известному способу, что свидетельствует о большей точности предлагаемого способа.

В табл.2 представлены результаты исследования, предпринятого с целью установления оптимального количества добавляемого бутилового спирта.

В табл.3 представлены сравнительные результаты определения кальция по предлагаемому способу при добавлении бутилового или изобутилового спирта.

В табл.4 представлены данные по устойчивости окраски цветного комплекса продукта реакции при определении кальция по предлагаемому способу с добавлением 1,75 мл бутилового или изобутилового спирта. Во всех исследованиях проводилось по 5 параллельных определений одной и той же пробы молока.

В табл.5 представлены данные спект- .ра поглощения цветного комплекса продукта реакции при определении кальция

314

в молоке по предлагаемому способу с добавлением 1,75 мл бутилового спирта.

Из представленных данных следует, что добавление бутилового спирта в объеме 1,75-1,8 мл достаточно для достижения поставленной цели. Дальнейшее увеличение объема добавляемого бутилового спирта не влияет на по- вьшение точности определения колыдая, а только приводит к достоверному снижению оптической плотности в связи с разбавлением раствора.

Из полученных результатов следу-

ет, что нет достоверной разницы в оптической плотности проб при добавлении 1,75-1,80 мл бутилового или изобутипового спирта.

Из представленных данных следует, что окраска цветного комплекса продукта реакции устойчива в интервале 6-15 мин от момента добавления раствора глиоксаль-бис-(2-оксиани- ла).

Из полученных результатов следует, что максимальное поглощение цветного комплекса наблюдается в диапазоне Л 530-540 нм.

Пример 1. В семь чистых сухих пробирок наливают по 1,0 мл дистиллированной воды, вносят в пробирки f 1, № 2, № 3 по 0,02 мл одной и той же пробы молока (разведенного в 10 раз дистиллированной водой), в пробирки № А, № 5, № 6 по 0,02 мл эталонного раствора кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л и в пробирку № 7 0,02 мл дистиллированной воды (раствор сравнения), перемешивают и вносят во все пробы по 0,5 мл раствора гидроокиси натрия с концентрацией ее 0,4 моль/л. Все пробы перемешивают и через 5-10 мин добавляют по 2,0 мл 0,1%-ного раствора глиоксаль-бис-(2- -оксианила) в метаноле, снова перемешивают и через 5 мин добавляют во все пробы по 1,75 мл бутилового спир-- та. После этого все пробы опять тща тёльно перемешивают и измеряют оптическую, плотность опытных и эталонных проб против раствора сравнения. Измерения проводят в 1 см кювете при длине волны 530-540 нм, не позднее 15 мин от момента добавления глиоксаль-бис-(2-оксианш1а).

Содержание кальция в молоке расс- читьшают по формуле

X

1-2,5

10,

-|Q

5

А Б 2,5 10 0

25

0

5

0

5

0

5

где X - содержание кальция в исследуемой пробе молока, ммоль/л;

оптическая плотность исследуемой пробы;

оптическая плотность эталонной пробы;

концентрация кальция в эталонной пробе, ммоль/л; степень разведения исследуемого молока.

Получены следующие результаты измерения оптической плотности исследуемых и эталонных проб: А № 1 (проба молока) 0,243, А № 2 (проба молока) 0,240; А № 3 (проба молока) 0,237; Б № 4 (эталонный -раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,198, Б № 5 (эталон- ньй раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,200; Б № б (эта- лонньй раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,203; средняя Б № 4-6 (эталонньй раствор кальция) 0,200.

По указанной формуле рассчитьшают концентрацию кальция в исследуемых пробах молока.

Х№ 1 (проба молока) 30,37 ммоль/л; X № 2 (проба молока) 30,00 ммоль/л, X Р 3 (проба молока) 29,63 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М 30,0; m ±0,261; & 0,370.

Пример 2. В том же образце молока (в трех параллельных пробах) аналогично примеру 1, только с добавлением на конечном этапе 1,8 мл бутилового спирта, определяют количество кальция, при этом получают следующие результаты оптической плотности исследуемой и эталонной проб: А № 1 (проба молока) 0,233; А № 2 (проба молока)

3(проба молока)

4(эталонньй раствор концентрацией его

2,5 моль/л) 0,192; Б № 5 (эталонньй раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,196; Б № 6 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,194} средняя Б № 4-6 (эталонный раствор кальция) 0,194.

0,236; А №

0,242j Б №

кальция с

По формуле, как и в примере 1, рассчитывают концентрацию кальция Ё исследуемых пробах молока.

X № 1 (проба молока) 30,03 ммоль/л, X № 2 (проба молока) 30,41 ммоль/л; X № 3 (проба молока) 30,92 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М 30,45; m 10,315; & 0,446.16

ПримерЗ. В том же образце молока (в трех параллельных пробах) аналогично «примеру 1, только с добавлением на конечном этапе 1,75 мл изобутилового спирта, определяют ко- личество кальция, при этом получают следующие результаты оптической плотности исследуемой и эталонной проб: А № 1 (проба молока) 0,244j А № 2 (проба молока) - 0,238 А № 3 20 (проба молока) 0,241; В № 4 (эта- лонньй раствор кальция с концентра- дней его 2,5 ммоль/л)0,203; Б № 5 (эталонньй раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммопь/л) 0,199; 25 Б № 6 (эталонньй раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,201; средняя Б № 4-6 (эталонный раствор) 0,201.

По формуле аналогично примеру 1 Q рассчитывают концентрацию кальция в исследуемых пробах молока. X № 1 (проба молока) 30,35 ммйль/л; X № 2 (проба молока) 29,60 ммоль/л; X № 3 (проба молока) 29,98 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М 29,97; m tO,265; 6 0,375

.40

Пример4. В том же образце молока (в трех параллельных пробах) аналогично примеру 1, только с добавлением на конечном этапе 1,80мл изобутилового спирта, определяют ко- дс личество кальция. При этом получены следующие результаты оптической плотности опытной и эталонной проб: А № 1 (проба молока) 0,234; А № 2 (проба молока) 0,232; А № 3 (проба молока) 0,241; Б № 4 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,197; Б № 5 (эталонньй раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,194; Б № 6 (эталонный раствор кальция с концентра- цией его 2,5 ммоль/л) 0,192; средняя Б № 4-6 (эталонный раствор) 0,194.

35

50

Q

0

с

5

0

По формуле аналогично примеру Г рассчитывают концентрацию кальция в опытных пробах молока.

X К 1 (проба молока) 30,1 5 ммоль/л; X № 2 (проба молока) 29,90 ммоль/л; Х№3 (проба молока) 31,06 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М 30,37; m ±0,431; 6 0,610.

Полученные результаты определения кальция в одних и тех же пробах молока с использованием граничных значений объемов добавляемого бутилового и изобутивлого спирта представлены в табл.6 (сравнительный анализ с использованием статистической обра- лотки результатов исследований не вьшвил различий между ними).

Таким образом, приведенные примеры доказьшают полное совпадение ре- результатов исследования молока на содержание кальция по предлагаемому способу при использовании граничных значений объемов бутилового и изобутилового спирта.

Пример 5. Определение кальция в трех параллельных пробах женского молока проводят по примеру 1, только молоко предварительно не разводят дистиллированной водой. Добавляют 1,75 мл бутилового спирта. Содержание кальция в исследуемой пробе молока рассчитывают по формуле

А

Y - . 9 S л - g yJ,

где X - содержание кальция в исследуемой пробе молока,

ММОЛЬ/Л}

А - оптическая плотность опытной

пробы;

Б - оптическая плотность эталонной пробы;

2,5- концентрация кальция в эталонном растворе, ммоль/л. Получены следующие результаты оптической плотности исследуемой (А) и эталонной (Б) проб; А № 1 (проба молока) 0,454} А № 2 (проба молока) 0,450; А № 3 (проба молока) 0,446; Б № 4 (эталонный раствор кальция с концентрацией ег-о 2,5 ммоль/л) 0,203; Б № 5 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,200; Б № 6 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,198; средняя Б № 4-6 (эталонньй раствор) 0,200.

7

По формуле, как в примере 4, рас считьгоают концентрацию кальция в опытных пробах молока.

X № 1 (проба молока) 5,67 ммоль/л X № 2 (проба молока) 5,62 ммоль/л X № 3 (проба молока) 5,57 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М 5,62 m ±0,035; 6 0,050.

Примерб. По примеру 5, только с добавлением на конечном этапе 1,80 мл бутилового спирта,определяют количество кальция в тех же пробах молока. Концентрация кальция в исследуемых пробах молока рассчитывают по формуле аналогично примеру 4 Получены следующие конечные результаты определения кальция в исследуемых пробах молока. X № 1 (проба молока) 5,61 ммоль/лi X № 2 (проба молока) 5,57 ммоль/лj X № 3 (проба молока) 5,66 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М 5,61 m ±0,032; 6 0,045.

Пример 7. По примеру 5, только с добавлением на конечном этапе 1,75 мл изобутилового спирта, определяют количество кальция в тех же пробах молока. Концентрацию кальция в исследуемых пробах молока рассчитывают по формуле аналогично примеру 5. Получены следующие конечные результаты определения кальция в исследуемых пробах молока. X № 1 (про- ба мопока) 5,63 ммоль/Л} X № 2 (проба молока) 5,56 ммоль/л; X № 3 (проба молока) 5,58 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М 5,59j m +0,025; Ь 0,036.

Примере. По примеру 5, только с добавлением на конечном этапе 1,8 мл изобутилового спирта, опреде

1

ляют количество кальция в тех же пробах молока. Концентрацию кальция в исследуемых пробах молока рассчитывают по формуле аналогично примеру 5. Получены следующие конечные результаты определения кальция в исследуемых пробах молока. X К 1 (проба молока) 5,56 ммоль/л; X № 2 (проба молока) 5,60 ммоль/л; X № 3 (проба молока) 5,65 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М 5,60; m +0,032, 6 0,045.

10

20

;

JQ

25

4463648

Полученные результаты определения кальция в одних и тех же пробах молока (при небольшом содержании его в молоке) с использованием граничных значений объемов бутилового и изобутилового спирта предстагшены в табл.7 (сравнительный анализ с использованием статистической обработки результатов исследования не выявил различий между ниьш).

Даким образом, приведенные данные показывают полное совпадение результатов определения кальция в молоке (при небольшом его содержании в нем) по предлагаемому способу при использовании граничных значений объемов бутилового и изобутилового спирта.

П р и М е р 9. Определение кальция в трех параллельных пробах молока проводят по примеру 1, причем молоко разводят в 10 раз дистиллированной водой. Добавляют 1,75 мл бутилового спирта. Содержание кальция в исследуемой пробе рассчитывают по формуле, как в примере 1.

Получены следующие результаты оптической плотности исследуемой и эталонной проб: А № 1 (проба молока) 0,680; А № 2 (проба молока) 0,675; А № 3 (проба молока) 0,685; Б № 4 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,202; Б № 5 (эталон- ньй раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,198; Б № 6 (эталонный раствор кальция с концентрацией его 2,5 ммоль/л) 0,197; средняя Б № 4-6 (эталонный раствор) 0,199.

Х№ 1 (проба молока) 85,43 ммоль/л; X № 2 (проба молока)84,80 ммолъ/л, X № 3 (проба молока)86,05 ммоль/л.

Такимм образом, для исследуемой пробы молока М 85,43-, f ±0,442; i 0,625.

Пример 10. Определение кальция проводят по примеру 1 в тех же разведенных в 10 раз дистиллированной водой пробах молока, что и в примере 9, только с добавлением на конечном этапе 1,80 мл бутилового спирта. Содержание кальция в исследуемой пробе молока рассчитывают по формуле, как в примере 1. Получены следующие конечные результаты определения кальция в исследуемых пробах. X № 1 (проба мсхпока) 85,46 ммоль/л;

40

45

50

55

X

№ №

2(проба молока) 86,09 ммоль/л;

3(проба молока) 84,18 ммоль/л. Таким образом, для исследуемой

пробы молока М 85,24; т tO,688i 6 0,973.

Пример 11. Определение проводят по примеру 1, в тех же разведенных в 10 раз дистиллированной водой пробах молока, что и в примере 9, только с добавлением на конечном этапе 1,75 мл изобутнлового спирта. Содержание капыщя в исследуемой пробе рассчитьюают по формуле, как в примере 1.

Получены следующие конечные резултаты определения кальция в исследуемых пробах: X № 1 (проба молока) 85,63 ммоль/л; X № 2 (проба молока) 86,25 ммоль/л; X № 3 (проба молока) 86,88 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пробы молока М m ±0,442; 6 0,625.

Пример 12. Определение проводят по примеру 1, в тех же разведенных в 10 раз дистиллированной водой пробах молока, что и в примере 9, только с добавлением на конечном этапе 1,80 мл изобутилового спир та. Содержание кальция в исследуемой пробе молока рассчитьшают по формуле, как в примере 1.

Получены следующие конечные резултаты определения кальция в исследуемых пробах. X № 1 (проба молока) 85,66 ММОЛЬ/Л , X № 2 (проба молока) 85,03 ммоль/л X № 3 (проба молока) 86,93 ммоль/л.

Таким образом, для исследуемой пр бы молока М 85,87; m ±0,684; 0,968.

Полученные результаты определения кальция в одних и тех же пробах молока (при большом его сцдержании в нем с использованием граничных значений объемов бутилового и изобутилового спирта представлены в табл.8 (сравнительный анализ с использованием статистической обработки результатов исследования не выявил различий между ними).

Таким образом, приведенные данные доказьтают полное совпадение результтов определения кальция в молоке (пр большом его количестве в нем) по пре лагаемому способу при использовании граничных значений объемов бутиловог и изобутилового спирта.

5

0

5

г

о

Формула изобретения

Способ определения кальция в биологической жидкости, преимущественно в женском молоке, предусматривающий обработку проб исследуемой биологической жидкости, эталонного раствора кальция и раствора сравнения путем последовательного введения в данные пробы щелочи и раствора реактива глиоксаль-бис-(2-оксианил), измерение значений оптической плотности образовавшегося комплекса красного цвета проб и определение кальция по соотношению измеренных значений оптических плотностей, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, определение значений оптической плотности проводят при длине волны 530-540 нм, а перед измерением значений оптической плотности в пробы вносят бутиловый или изобутиповый спирт в количестве, обеспечивающем исчезновение мутности проб.

Таблица 1

,

5 Известный

Предлагаемый

0

0,245

0,241 0,238 0,24,0 0,236

,240 т ±0,0017 ,0034 0,720

0,655

Проба прозрачная

То же

Проба очень мутная

То же

0,690 0,745 0,660 ,694

5

,Ol9 .038

Примечание. Большая оптическая плотность проб при опре- делетш кальция в молоке по известному способу обусловлена значительной мутностью проб.

2

Изобретение относится к способам исследования состава мопока с помощью набора химических реактивов, включакмцих глиоксаль-бис-(2-ок- сианил) и направлено на повышение точности. По реакции содержащегося в пробе молока кальция с указанным реактивом в щелочной среде с образованием комплекса красного цвета фо тометрическим измерением определяют к 1чество кальция. При этом в про- С . исследуемого молока дополнительно вносят бутиловьй или изобутиловьй спирт в количестве, обеспечивающем исчезновение мути. Измерение значений оптической плотности проводят при длине волны 530-540 нм. 8 табл. с СЛ

М 0,360 m tO,Ol27 6 0,0254

М 0,300 m ±0,0079 6 0,0t58

М, ±0,240 m ±0,0016 d 0,00316

N4 0,236 m +0,0021 6 0,0042

1,0

Проба мутная То же

1,5

Проба слабо мутная То же

1,75

Проба прозрачная То же

1,8

Проба прозрачная То же

М 0,228 m +0,0014 у 0,0028

М 0,200 га +0,0019 6 0,0038

имечание; t, - tj 1,51 t,- t3 5,64 ti- t3 3,17

Оптическая плотность пробы (Е) при добавлении спирта

1,75 нп

1

М, 0,240 ю tO,0016 & - 0,00316

& 0,0042

М,- 0,239 ы -tO,0020 & 0,0040

1,80 кп

Бутнлового

0,238М 0,236

0,232m 0,0021

0,235 0,242 0,232

Иэовутипового 0,237 0,243 0,23.2 0,235 0,233

0,236

m «+0,0021 i- 0,0043

Продолежение табл. 2

1,85

-

2,0

P,., 70,1 P,.3 0,01 P2.,05

Таблица 3

Достоверность, Р

& 0,0042

0,236

0,0021 0,0043

1-j

0,39

Р,0,1

t ,- 1,52

ft. Ч-% .3 Р,., 0,1

PI 0. t

t,.,. 1.03 P,.,.0.1

151446564 -i 6

Таблица 4

Измерение на спектрофотометре, кювета с толщиной рабочего слоя 10 мм, Д 535 нм. Концентрация исследуемого раствора кальция, 2,5 ммоль/л,

Примечание: Mtm рассчитьшают из пяти параллельных проб.

Достоверность измерений оптической плотности рассчитьшают по отношению к оптической плотности на 14-й минуте.

Таблица5

Измерение на спектрофотометре, кювета с толщиной рабочего слоя 10 мм. Концентрация исследуемого раствора каль- Q ция 2,5 ммоль/л.

0,056 0,074 0,090 0,105 0,130 0,168

Продожение табл. 5

57U46564

Продолжение табл. 5

0,191 0,183 0,165

Объем добавляемого спирта, мл

Бутиловый 1,75 Вутиловьй 1,80

Изобутиловый 1,75

Изобутиповый 1,80

18

Продолжение табл. 5

0,130 0,095 0,065

Таблица 6

Концентрация кальция, ммоль/л (M-fm), в пробах молока

tt-2 МО Р,1 0,1

t f-3 0,73 Pf-370,1 t,.4 0.73 P 1-4 0,1

t,., 0,15

P ,1 1,16

P i.30,1 t 3., 0,79

P }-4 70,1

Таблица 7

19

Концентрация кальция t ммоль/л (Mfm), в пробах молока

85,43tO,0442. 85,24tO,688

86,25tO,442 85,87+0,684

20

Таблица 8 Показатели достоверности

,I P..1 P,-4 0,1

Pi-э ОП P 1.470,1

РЗ-.40,1