Способ определения концентрации меди и железа в грудном молоке Советский патент 1993 года по МПК G01N21/78 

Изобретение относится к аналитической химии и медицине, а именно к способам количественного определения железа и меди в грудном молоке кормящей матери и может быть использовано при диагностике алиментарных анемий при дефиците в молоке кормящей матери железа и меди, являющихся гемопотическими факторами при гемоглобинообразовании.

Известен способ определения концентрации меди и железа в грудном молоке методом атомной-абсорбционной спектро- фотометрии.

Недостатком способа является длительность определения из-за длительности подготовки пробы к анализу.

Наиболее близким к описываемому по технической сущности и достигаемым результатам является способ определения железа и меди в грудном молоке путем депро- теинизирования анализируемой пробы отдельно для меди и отдельно для железа разными растворами с последующей обработкой дёпротеинизированных проб цвето- реагентами и спектрофотометрированием окрашенных растворов.

Недостаток способа тот же - длительность проведения определения.

Целью изобретения является сокращение времени определения.

Поставленная цель достигается описываемым способом определения концентрации железа и меди в грудном молоке путем депротеинизирования анализируемой пробы, обработки метанол-хлороформной смесью состава, % объем метанол 30-35, хлороформ 65-70 и цветореагентом на каждый биометалл последовательно в одной пробе.

ю

4 О

Ю

Отличительным признаком способа является обработка депротеинизированной пробы метанол-хлороформной смесью состава, % объем метанол 30-35, хлороформ 65-70 и определение биометаллов последовательно в одной пробе.

Изобретение иллюстрируется следующим примером. Аликвоту молока (пробу) в объеме 1 мл дозатором переносят в чистую стеклянную центрифужную пробирку и подвергают депротеинизации добавлением 1 мл смеси для осаждения белков (концентрированная тио.гликолевая кислота, трихло- руксусная кислота 0,6 моль/л, соляная кислота 2 моль/л). Суспензию тщательно перемешивают, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Су- пернатант (надосадочную жидкость) отбирают при помощи дозатора в объеме 1 мл, переносят в чистый стеклянный сосуд с притертым шлифом и смешивают с 1 мл смеси метанол-хлороформ (Реахим, хч) в соотношении 30 мл метанола и 70 мл хлороформа. Далее эту суспензию интенсивно встряхивают в течение 2 мин и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Экстрагированные липиды и липопротеиды собираются на границе раздела двух фаз - плотной (хлороформ) и менее плотной (метанол). При помощи дозатора отбирают верхнюю фазу в объеме 1 мл, переносят в чистую центрифужную стеклянную пробирку и смешивают сначала, с 1 мл реагента на медь (2, 9-диме- тил-4, 7-дифенил-1, 10-фенантролин-З, 6-ди- сульфонат). После смешивания пробу оставляют стоять в течение 5 мин, времени в течение которого развивается интенсивное желтое окрашивание (стабильное окрашивание сохраняется в течение не менее 1 ч после добавления реагента). Параллельно готовят аликвоты раствора сравнения и эталонного раствора. Раствор сравнения представляет собой смесь 1 мл бидистилли- рованной воды и 1 мл смеси для осаждения белков. Эталонный раствор в процедуре определения меди представляет собой смесь 1 мл эталонного раствора, содержащего 30 мкмоль/л меди и 1 мл смеси для осаждения белков, Из 2 мл исходных растворов сравнения и эталонного отбирают по 1 мл каждого и смешивают их с 1 мл смеси метанол-хлороформ. После добавления смеси метанол-хлороформ пробы, содержащие раствор сравнения и эталонный раствор, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. При помощи дозатора отбирают верхнюю фазу в объеме 1 мл. переносят в чистую центрифужную стеклянную пробирку и смешивают с 1 мл реагента на медь.

Оптическую плотность пробы и эталонного раствора измеряют против раствора сравнения в кварцевой кювете (длина светового пути 1 см) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 480 нм.

Расчет концентрации меди в пробе молока производят по формуле

10

/ - |- X v, Ь

где X - содержание меди в пробе в мкмоль/л, А- оптическая плотность пробы, Б - оптическая плотность эталонного раствора, С - концентрация меди в эталонном растворе после обработки смесью метанол- хлороформ в мкмоль/л, т, е. содержание меди в эталонном растворе с учетом разбавления маточного эталонного раствора после обработки смесью метанол-хлороформ.

Время определения концентрации меди в пробе грудного молока, а также погрешность этого определения приведены в

таблице.

После определения содержания меди в этих же пробах проводят определение концентрации железа, для чего в каждую пробу добавляют по 1 мл реагента на железо (батофенантролин, т. е. 4, 7-дифе- нил-1, 10-фенантролин) и оставляют стоять не менее 5 мин. После развития интенсивной розовой окраски раствора, измеряют оптическую плотность проб на

спектрофотометре СФ-26 в кварцевой кювете (длина светового пути 1 см) при длине волны 535 нм.

Для расчета содержания железа в пробах параллельно готовят раствор сравнения

в эталонный раствор железа. Раствор сравнения представляет собой смесь 0,5 мл би- дистиллированной воды и 0,5 мл смеси для осаждения белков, а эталонный раствор - 0,5 мл смеси для осаждения белков и 0,5 мл

эталонного маточного раствора, содержащего 17, 9 мкмоль/л железа. Раствор сравнения и эталонный раствор также подвергают обработке смесью метанол-хлороформ, после чего пробы содержащие эти

растворы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Дозатором отбирают верхнюю фазу в объеме 1 мл и добавляют последовательно сначала 1 мл реагента на медь и затем 1 мл реагента на железо.

Оптическую плотность проб при определении содержания в них железа и эталона измеряют против раствора сравнения.

Расчет концентрации железа в пробе производят по формуле

У -Ј- хСх2, ь

где У - концентрация железа в пробе в мкмоль/л, А - оптическая плотность пробы, Б - оптическая плотность эталонного раствора, С - концентрация железа в эталонном растворе после обработки смесью метанол-хлороформ в мкмоль/л, 2 - коэффициент, компенсирующий разбавление проб и эталона за счет добавления 1 мл реагента на медь.

Депротеинизурующую смесь для денатурации белков молока готовят, смешивая 3 мл концентрированной тиогликолевой кислоты в мерной колбе емкостью 100 мл с трихлоруксусной кислотой в конечной концентрации 0,6 моль/л, содержащей также соляную кислоту в конечной концентрации 2 моль/л.

Цветореагенты на медь и железо в опи- сываемомспособе используют в готовом виде из коммерческих наборов Био-Ла-Тест Медь и Железо. В отсутствии готовых

0

5

0

5

цветореагентов их готовят следующим образом, на железо - в пробирке к 100 мг 4, 7-дифенил-1, 10-фенантролина (батофенан- тролина) добавляют 0,5 мл хлорсульфоно- вой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30с, охлаждают и медленно приливают 10 мл воды, после чего снова нагревают на водяной бане 5 мин и разбавляют 100 мл дистиллированной воды. Устанавливают рН 4,0, добавляя раствор 5 н. NaOH, и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл. Цветореагент на медь готовят аналогичным образом, только вместо 4, 7-дифенил-1, 10-фенантролина используется его производное - 2, 9-диметил-4, 7-дифенил-1, 10-фенантролин.

Время определения концентрации железа в пробе грудного молока, а также погрешность этого определения приведены в таблице.

Суммарное время определения железа и меди по описываемому способу составляет 38-44 мин (по известному 80 мин) при той же чувствительности и точности.

Использование: в аналитической химии и медицине при диагностике алиментарных анемий при дефиците в молоке кормящей матери биометаллов - железа, меди и др., являющихся гемопотическими факторами при гемоглобинообразовании. Сущность изобретения; анализируемую пробу молока депротеинезируют, обрабатывают смесью, метанола 30-35 об. % и хлороформа 65-70 об. %. и цветореагентом на каждый биометалл последовательно в одной пробе с последующим спектрофотометрированием окрашенных растворов. Время проведения определения 44 мин. 1 табл.

Формул а изобретения

Способ определения концентрации ме. ди и железа в грудном молоке путем депротеинезирования анализируемой пробы с

последующей обработкой цветореагентами

и спектрофотометрированием окрашенных

растворов, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения. депротеинезированные пробы перед обработкой цветореагентом обрабатывают смесью метанола 30-35 об. % и хлороформа 65-70 об. % и определение железа и меди ведут последовательно в одной пробе.