Способ получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

со

00

м

Изобретение относится к области .биотехнологии и касается получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В. Цель изобретения - по- вьшение выхода продукта. В предложенном способе повышение выхода HBsAg обеспечивается за счет использования рекомбинантной плазмидной ДНК, которую получают в результате культивирования S.Cerevisial, трансформированных плазмидой, которая содержит мар- керньш ген для E.coli и дрожжей и реплицируется как в E.coli, так и в дрожжах, при этом ген антигена в HBsAg в данном плазмиде встроен вниз от промотора кислой фосфатазы. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

ч1

00

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В.

Цель изобретения - повьшение выхода конечного продукта.

Повьппение выхода HBsAj обеспечивается за счет использования рекомбимощью ДНК полимеразы однонитевая область ДРШ достраивается до полностью двунитиевой, при этом получают материал, меченый (32Р). Этот матери ал добавляют в верхнюю часть пробирки для центрифугирования, в которой по слоям в указанном порядке содержатся 30, 20 и 10%-ные растворы санантной плазмидной ДНК, которую полу- ю харозы, пробирку подвергают центричают.в результате культивирования Saccharorayces cerevisiae, трансформированной плазмидой, которая содержит маркерный ген для Е,coli и дрожжей.

С тем, чтобы разрушить фермен протеины, прочно связанные в ,ДНК

и может реплицироваться как в E.coli, 15 полученные осадки обрабатывают в

20

так и в дрожжах, при этом ген антигена HBsAg в данной плазмиде встроен вниз от промотора кислой фосфатазы, в котором часть или полньш структурный ген кислой фосфатазы -или некоторая область вверх от структурного гена кислой фосфатазы удалена.

Пример 1. Собирают плазму крови (700 мл), взятую у десяти пациентов, с положительной реакцией на 25 HBsAg (подтипа adr) и на HBsAgj затем ее подвергшот центрифугированию со скоростью 5000 об/мин в течение , 20 мин с целью удаления нерастворенных материалов. Полученный в резуль- 30 тате раствор подвергают центрифугированию при 4°С со скоростью 18000 об/мин в течение 8ч, а полученный осадок вновь растворяют в 10 мл буфера (рН 7,5) 10 ьй Tris-HCl, 0,1 М NaCl и 1 мМ ЭДТК. Полученньй раствор добавляют в верхнюю часть пробирки для центрифугирования, содержащей 30% сахарозы, которую центрифугируют при со скоростью 39000 об/мин в течение 4 ч. Полученный в результате осадок вновь растворяют в том же буфере,

С целью облегчения последующих операций буферньй раствор подвергают 45 реакции с ДНК полимеразой вируса гепатита В, при помощи его обработки в смеси (500 мкл) 67 мМ Tris-HCl (рН 7,5), ВО мМ , 25 мМ MgClg., 0,5% NP40 (тергитол, производимый фирмой Сигма Ко), 0,1% 2-меркапто- зтанола,330 мкмдДТФ (дезоксицитидин трифосфата),дГТФ (дезоксигуанозин трисЬосЛата) и дАТФ (дезоксиаденозин

35

40

50

смеси 1 мг/мл проназы Е, которая изводится фирмой Какен Кагаку К. и 0,2%-ного водного раствора лаур : сульфата натрия при З7 с в течени 2ч. Полученную в результате смес дважды экстрагируют фенолом (200 Э Полученньй в. результате экстрак содержащий ДНК, промывают простым эфиром с тем, чтобы удалить фенол после чего получают раствор ДНК в руса гепатита В. Полученная таким разом ДНК обладает удельной радио активностью 2,5x10 отсчетов/мин

. 1 МКС.

Полученную двунитевую кольцеву ДНК вируса гепатита В (ВГВ)- клони с использованием ДНК А -фага Шаро 16А в качестве вектора, а затем вновь клонируют в плазмиду рАСУС1

ДНК ВГВ (20 нг) обрабатьшают э нуклеазой Xho 1 в смеси (20 мкл) 10 мМ Tris - НС1 (рН 7,4), 7 мМ M 100 мМ NaCl и 7 мМ 2-меркаптоэтан при 37 С в течение 2 ч. Полученну результате смесь экстрагируют фен (20 мкл) и затем простым эфиром, водньй слой добавляют двойной объ охлажденного этанола с тем, чтобы ДНК вьшала в осадок. Смесь выдерж вают при -70°С в течение 1 ч, а з тем центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 5 мин, а о денную ДНК извлекают. Полученные ким образом осадки отделяют и рас ряют в смеси (5 л) 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТК. ДНК ВГВ и р номолярное количество ДНК Л-фага рон 16А (имеющей один сайт узнав для Xho I), полученная в результа

трифосфата, О, 5 мкМ (Р) дТТФ (дазтс рассечения эндонуклеазой сечения

окситимидин трифосфата) при в течение 3 ч и в реакционную смесь добавля ют-тот же объем 100 i раствора ЭДТК. В результате упомянутой реакции с поXho I тем же методом, что использ вался выше, обрабатывают ДНК-лига зой Т4 смесь 50 мМ Tris-HCl (рН 7 10 f MgCl, 10 мМ дитиотрейтола.

мощью ДНК полимеразы однонитевая область ДРШ достраивается до полностью двунитиевой, при этом получают материал, меченый (32Р). Этот материал добавляют в верхнюю часть пробирки для центрифугирования, в которой по слоям в указанном порядке содержатся 30, 20 и 10%-ные растворы сахарозы, пробирку подвергают центрифугированю при 4 С со скоростью 39000 об/мин в течение 4,5 ч.

С тем, чтобы разрушить ферментом протеины, прочно связанные в ,ДНК,

полученные осадки обрабатывают в

0

5 0

5

5

0

0

смеси 1 мг/мл проназы Е, которая производится фирмой Какен Кагаку К.К. и 0,2%-ного водного раствора лаурил : сульфата натрия при З7 с в течение 2ч. Полученную в результате смесь дважды экстрагируют фенолом (200 л), Э Полученньй в. результате экстракт, содержащий ДНК, промывают простым эфиром с тем, чтобы удалить фенол, после чего получают раствор ДНК вируса гепатита В. Полученная таким образом ДНК обладает удельной радиоактивностью 2,5x10 отсчетов/мин на

. 1 МКС.

Полученную двунитевую кольцевую ДНК вируса гепатита В (ВГВ)- клонируют с использованием ДНК А -фага Шарон 16А в качестве вектора, а затем вновь клонируют в плазмиду рАСУС177.

ДНК ВГВ (20 нг) обрабатьшают эндо- нуклеазой Xho 1 в смеси (20 мкл) 10 мМ Tris - НС1 (рН 7,4), 7 мМ MgCl, 100 мМ NaCl и 7 мМ 2-меркаптоэтанола при 37 С в течение 2 ч. Полученную в результате смесь экстрагируют фенолом (20 мкл) и затем простым эфиром, а в водньй слой добавляют двойной объем охлажденного этанола с тем, чтобы ДНК вьшала в осадок. Смесь выдерживают при -70°С в течение 1 ч, а затем центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 5 мин, а осажденную ДНК извлекают. Полученные таким образом осадки отделяют и растворяют в смеси (5 л) 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТК. ДНК ВГВ и рав- номолярное количество ДНК Л-фага Ша- рон 16А (имеющей один сайт узнавания для Xho I), полученная в результате

с рассечения эндонуклеазой сечения

Xho I тем же методом, что использовался выше, обрабатывают ДНК-лига- зой Т4 смесь 50 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 10 f MgCl, 10 мМ дитиотрейтола.

10 мкг/мл альбумина сыворотки теленка, 0,5 мМ АТФ и 0,5 мкл лигазон ТА, производимой фирмой Тикара биомеди- калз, 1-5-10 единиц/мл при 4°С в те- чение 18 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом и простьм эфиром, а затем подвергают осаждению фенолом. Полученные таким образом осадки растворяют в смеси (10 мкл) 10 мМ TrisНС1 (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТК.

Рекомбинатную ДИК упаковывают и получают Д-фаги, которые затем на плоском L-arape (23x23 см) образуют бляшки (10) с использованием SupF ДР50 Е. coli в качестве индикатора. Такие бляищи подвергают гибридизации с использованием в качестве зонда

ДНК ВГВ, меченой

32 ,

С тем, чтобы

можно было выделить бляпп :и,образован- ные фагом, содержащим ДНК ВГВ. ДНК фага получают с использованием ДР50- SupF E.i-.oli в качестве инфецируемой бактерии. Полученную таким образом ДНК обрабатывают ферментом Xho I при тех же условиях, что описаны, в течение 2 ч и полученную в результате реакционную смесь подвергают электрофорезу с использованием 0,75% агарового геля с целью выделения ДНК ВГВ (3,2 Кб). ДНК ВГБ абсорбируют на ДЭАЭ (диэтиламиноэтил целлюлоза - бумагу, производимую фирмой Тойо Роши, Япония) с тем, чтобы отделить ДНК носителя, а затем элюируют 1 М водным раствором NaCl с тем чтобы получить ДНК ВГВ, имеющую Xho 1 сайты с обеих сторон.

Отдельно плазмиду рАСУС17-7, содержащую единственньм сайт сечения Xho 1 внутри ее гена стойкости к канамицину, обрабатывают Xho 1, а продукт подвергают очистке при помо щи экстракции фенолом, обработки простым эфиром и осаждению этанолом. Полученную таким образом плазмиду рАСУС177, рассеченную ферментом Xho 1 ДНК ВГВ в молярном отнощении 1:5, а смесь сшивают ДНК Т4-лигазой в течение 1Й ч.

Выделение ДНК (10 мкл) осуществляют следую1 шм образом: обрабатывают культуральный бульон штамма Е . со.1 i v1776, эту смесь тщательно перемешивают и выдерживают при в течение

55

25 мин. Смесь помещают на L-агаровую пластину, содержащую ампициллин (20 мкг/мл), о(-биотин (1 мкг/мл), диаминопимелиновую кислоту (100 мкг/мл)

o

5

0 5

0

5

0

5

0

5

и тимин (20 мкг/мл), и инкуюируют при 37 С в течение ночи. Полученные в результате колонии помещают на агаровую пластинку, содержащую канами- цин (20 мкг/мл), на агаровую пластинку, содержащую ампициллин (20 мкг/мл) причем колонии, которые растут только на агаровой пластинке, содержащей ампициллин, отбирают рАСУС177 содержит ген стойкости к ампициллину и ген стойкости к канамицину, но когда ДНК-ВГВ встраивается в сайт Xho 1 гена стойкости к канамицину, он теряет свойство стойкости к канамицину. В соответствии с этим выбранные колонии содержат рекомбинант- ную ДНК РАСУС177-ДНК ВГВ. Из выбранных таким образом колоний получают плазмиду, т.е. рекомбинантную ДНК рАСУС177 - ДНК ВГВ (которую обозначают через рНВУ), обрабатывают ферментом Xho 1, в результате получают весь фрагмент ДНК ВГВ (3,2 к Ь) . Когда плазмиду обрабатывают ферментом Xho 1 и ферментом ВамН1, то получают фрагмент (примерно 1,3 кЬ), содержащий ген HBsAg.

Фрагмент EcoRI в примерно 8000 нук- леотидных пао (8 кЬ), содержащий ген полипептида (РбО) в 60000 дальтон, которьй составляет репрессируемый ген кислой фосфатазы, получают из банка генов S288C дрожжей и вставляют в сайт EcoRI плазмиды pBR322 E.coli, в результате чего получают исходную плазмиду. .

Исходную плазмиду обрабатывают эндонуклеазой Sail и сшивают ДНК - лигазой Т4, при этом получают плазмиду рАТ25, которая имеет пробел от сайта Sal 1 до фрагмента гена кислой фосфатазы 5,2 кЬ. Плазмида рАТ 25 является плазмидой, coдepжaп eй фрагмент (примерно 3,7 кЬ) от сайта EcoRI до сайта Sal I в pBR322, который содержит ген стойкости к ампициллину и фрагмент (примерно 2,8 кЬ) от сайта EcoRI до сайта Sal 1 гена дрожжей кислой фосфатазы.

В EcoRI сайт рAT 25 вставляют фрагмент EcoRI (1,4 кЬ), содержащий ars 1 и ген Тгр 1, который получают в результате обработки плазмиды yRP 7 ферментом EcoRI, при этом получают плазмид рАТ 26. Фрагмент ars 1-Тг р 1 содержит единственный сайт указыва- ния для фермента сечения Hind III -внутри гена Тгр 1.

В сайт Hind III плазмиды рАТ 26 вставляют Hind III - фрагмент, содержащий Len 2 и 2 jU ori, который получают в результате обработки плазмиды pSLE 1 ферментом Hind III с тем, чтобы получить челночньш вектор рАТ,77. рАТ 77, содержащийся в S.ce- revisiae (т.е. Saccharorayces cerevi- siae АН 22 (pAT 77) сдан на хранение в Исследовательский Институт Ферментации, Агенство по промыпшенной науке и технологии, Япония, в соответст- .вий с Будапештским соглашением FEPM ВР-324)..

Долученньш таким образом рАТ 77 (1 мкг) рассекают ферментом Sal 1, а затем обрабатывают эксонуклеазой BAL 31 (0,1 и) в растворе (50 мкл) 20 мМ Tris-HCl (рН 8,2), 12 мМ CaCl, 12 мМ MgCl, 0,2 М, NaCl и 1 мМ ЭДТК в течение от 30 с до 1 мин. Реакционную смесь подвергают .экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные в результате осадки обрабатывают линкером Xho 1 (1 нмоль) и ДНК - лигазой Т 4 при тех же услоБИях что описаны, в течение 12 ч.

Трансформирзтот E.coli Х.1776 полученной плазмидой и получают трансформированную культуру, стойкую к ампициллину, -Из колоний выделяют ДНК плаз МИДЫ, определяют нуклеотидную последовательность ДНК, а затем определяют область гена кислой фосфатазы, удаленную при помощи BAL 31. Среди этих ДНК отбирают и вьщеляют искомые плазмиды рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84, в которых полностью отсутствует струк турньш ген фосфатазы.

Обозначают А в кодоне ATG,. кодирующем первую аминоки.слоту (метионин) продукта РбО структурного гена фосфатазы, через челночных носителях удаляют следующие области, рАМ 81: до +2, рАМ 82: до - 33., рАМ 83: до -50 и рАМ 84: до -51. рАМ 8l, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84, содержащиеся в Saceharorayces serevisiae- (т.е.Засе- haromyces cerevisiae АН 22 (рАМ 81, АН 22) рАМ 82, АН 22 (рАМ 83 и АН 22) рАМ 84,- сданы на хранение в Исследовательский Институт ферментации,.Агенство по промышленной науке и техно

логин. Япония, в соответствии с Буда пештским соглашением FEPM ВР-325, FEPN ВР-313, FEPM ВР-327 и FEPM ВР-326.

10

15

20

25

.,. 30

35

40

55

Полз енную ДНК ВГВ в результате обработки плазмиды рНВУ (рАСУС 177- ДНК ВГВ) ферментом Xho 1 подвергают, рекомбинации с челночным вектором, рассеченным Xho 1, рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84 в молярном отношении 5:1 при помощи сшивки ДНК лигазой Т4. .

E.coli X 1776 трансформируют данной ДНК плазмидой, получают из трансформированной культуры стойкие к ампициллину колонии. Выделяют из них ДНК и .анализируют с использова нием разлртчных ферментов сечения таких, как Xho 1, Xha 1 и Hind III, при этом идентифицируется вставка ДНК БГВ в носители и ее направление.

. Фрагмент гена HBsAg (3 мкг), по.лу- ченньй в результате рассечения плазмиды рНВУ ферментом ВамН1, обрабатывают ДНК - полимеразой Т4 (0,2U) в растворе (100 мкл) 67 i Tris-HCl (рН 8,6), 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-мер- каптоэтанола, 6,7 мкМ ЭДТК и 16,7 мМ (Ш4)з804, которьй содержит 200 мкМ о.АТФ,аС.ЦТФ, ХТТФ иЛГТФ в течение 30 мин с тем, чтобы заполнить конец сечения ферментом ВамН1.- Реакционную смесь подвергают экстрагированию фенолом и осаждению этанолом,Осадки подвергают реакции сшивания с линкером Xho,1 в молярном отношении 1:10 при помощи ДНК- лигазы Т4. После экстрагирования фенолом и осаждения этанолом ДНК плазмиды обрабатьшают Xho 1, при этом получают фрагмент гена HBsAg-(примерно 1,3 кб), содержащий терминал сечения Xho 1 на обоих концах. Этот фрагмент сшивают с челночным вектором рАМ 82, которьй рассекают-ферментом Xho .1, в молярном отношении 5:1 с использованием ДНК - лигазы Т4, трансформируют кишечную палочку E.coli X 1776 полученной рекомбинантной ДНК„ , .

В эту плазмиду вставляют HBsAg ген в правильном направлении вниз от.промотора фосфатазы вектора рАМ 82,

Исходными дрожжами являются Sace- haromyces cerevisiae АН22 (а, len 2, his 4, caul (Cir)), которые сданы.на хранение в Исследовательский институт ферментации, Агенство по промышленной науке и технологии, Япония, в соответствии с Будапештским соглашением под наименованием FEPM ВР-312. Исходные дрожжи помещают на среду УРВ (-100 мл), содержащ-ую 2% полипептона, 1% экстрак- fa дрожжей и 2% глюкозы, затем смесь

инкубируют при 30°С в течение ночи и далее клетки собирают при помощи центрифугирования. Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мл), суспендируют в раствор 1,2 М сорбита и 100 мкг/мл зимо- лиазы -60000 (которая производится фирмой Сейкагаку Когио К,К., Япония), суспензию вьщерживают при в течение 30 мин, в результате чего получают сферопласт. Полученньй таким образом сферопласт промьшают 1,2 М раствором сорбита три раза, а затем суспендируют в раствор (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ CaCl и 10 мМ Tris - HCl (рН 7,5). Суспензию реализзпот в маленькие пробирки в объеме 60 мкл. В суспензию добавляют раствор рекомби- нантной плазмиды рАН 203 (30 мкл). После тщательного перемешивания в смесь добавляют 0,1 М СаС1(3 мкл) до комнатной концентрации СаС в 10 мМ, затем смесь вьщерживают при комнатной температуре в течение 5- 10 мин. Б полученную в результате смесь 1 мл раствора 20% полиэтилен- гликоля 4000, 10 мМ CaCl и 10 мМ Tris - HCl (рН 7,5), затем смесь выдерживают при комнатной температуре в течение примерно 20 мин. Смесь (каждую объемом 0,2 мл) добавляют в среду (10 мл), состоящую на 22% из сорбита, на 2% из глюкоЗы, на 0,7% из- аминокислоты на основе азота дрожжей, на 2% из yPD, на 20 мг/мп из гистиди- на и на 3% из агара и выдерживают при постоянной температуре в 45 С.После энергичного перемешивания смесь помещают слоем на пластинку с мини- мальной средой, содержащей 1,2 М сорбита,, которую приготавливают заранее она содержит 0,7% аминокислоты на базе азота дрожжей, 2% глюкозы, 20 мкг/мл гистидина и 2% агара Пластинку инкубирзтот при , в результате чего получают колонию дрожжей,не зависящих от леудина.Колонию инкубируют в минимальной среде Берк Холь- дера с добавкой гистидина (20 мкг/мл; в результате чего получают искомые трансформированные дрожжи:Saceharomy.ces cerevisiae рАН 203.

: Тем же способом, однако вместо ре- комбинантного рАН 203 используют ре- комбинантные плазмиды, PAS 101, рАН 201 и рАН 205; получают следующие трансформированные дрожжи:Saceharomy

ces cerevisiae pAS 101, S.Cerevisiae pAH 201, S.Cerevisiae pAH 205,

Каждую колонию трансформированных рожжей наносят на агаровую пластинку с минимальной средой Берк Хольдера, ополненной гистидином (20 мкг/мл) и осуществляют инкубирование при до образования колонии. Полученные в результате клетки отделяют от колонии, прививают на минимальную среду Берк Хольдера, дополнительную гистидином (20 мкг/мл) и инкубируют при 30°С. Спустя примерно 24 ч клетки в стадии логарифмического роста собирают центрифугированием, суспендируют в минимальнзт) среду (.10 мл), но содержащую фосфорную кислоту (которая приготавливается заменой KHjP04 в минимальной среде Берк Хольдера на КС1 и последующим добавлением 20 мкг/мл гистидина), с кон /

центрацией клеток примерно 4x10 клеток/мл. После инкубирования при 30°С в течение примерно 24 ч культураль- ньй бульон подвергают центрифугированию со скоростью 4000 об/мин в течение 10 мин с целью сбора клеток. Собранные таким образом клетки суспендируют в. раствор (3 мл) 1,2м сорбита, 50 мМ буфера фосфата (рН 7,2), 14 1 2-меркаптоэтанола и 100 г/мл Зимолиазы - 60000 (производимой фирмой Сейкагаку Когио К.К, Япония), а затем смесь энергично встряхивают при в течение 30 мин с тем, чтобы получить сферопласт. Сферопласт собирают при помощи центрифугирования и тщательно суспендируют в раствор (1 мл) 0,1% тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), суспензию энергично перемешивают, а затем центрифугируют со скоростью 7000 об/мин в течение 10 мин, при этом верхний слой образует раствор лизированных дрожжей.

Полученный раствор (20 мкл) ис-. пытывают с использованием устройства для РИА на HBS антиген (производимо- го фирмой Эбботт, США) по HBS антигенной активности. Результаты приведены втаблице,

Что касается раствора лизированных дрожжей, полученного из S.cerevisiae АН 22/рАН 203, то предполагается, что активность и количество антигена находятся в соответствии статической параллельной подмой при использовании устройства для обнаружения HBaAg, причем в качестве контрольного антигена используется очищенный HBsAg, полученньй из сыворотки крови человека.

Дозированный раствор (каждая пор- ция 0,4 мл) подкожным способ ом вводят гвинейским свинкам (самки, 300-380 г, 10 животных) один раз в неделю в течение трех недель,а антитела в плазме ™ крови определяют при помощи устройства для обнаружения анти-HBS антител (АУСАБ, производимого фирмой Эбботт, США). В результате у всех животных обнаружены айти-НВЗ антиге нао .Формула изобретения 1. Способ получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В, включающий конструирование челночно- 20 го вектора путем объединения фрагмента ДНК Saceharomyces cerevisiae, содержащего ars 1,2pori и селективный маркер для отбора трансформированных . S.cerevisiat; с фрагментом ДНК Esche- 25 richia coli, содержащим ген репликации плазмиды, а также селективньй маркерньй ген для отбора трансформированных плазмидой E.coli, введение в него участка ДНК, кодирующего ген , поверхностного антигена гепатита В (HBsAg), которьй находится под контролем дрожжевого промотора, с последующим культивированием трансформированных плазмидой SoCerevisiae, выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повыщения выхода конечного продукта, конструирование вектора осуществляют введением в E.coRI сайт „

4U

плазмиды pBR322 гена кислой фосфата- зы Р60, вьщеленного из банка генов S 288С дрожжей, далее обрабатывают зндонуклеазой Sal I и ДНК-лигазой

S. cerevisiae

АН 22 (FEPM ) рАН 201 10.597 2- -рАН 203 13,.008

-

Т4 и получают плазмиду рАТ25, включают в Sal I плазмиды рАТ25 фрагмент arsl-trpi, вьщеленньй из плазкиды 4Р7, полученную плазмиду рАТ 26 обрабатывают зндонуклеазой Hind III и вводят фрагмент Len 2 и 2//ori плазмиды pS2F, после чего получен- ньй вектор рАТ77 и фрагмент, содержащий ген НВзАр; подтипа , выделенный из плазмиды pHBV с помощью фрагмента Ват HI, обрабатывают эндо- нуклеазой Xho I, сшивают полученные фрагменты ДНК-лигазой Т4 и отбирают рекомбинантные плазмидные ДНК , в которых ген HBsAg расположен ниже области промотора

2,Способ по п. 1, отлича ю- щ и и с я тем, что вектор рАТ77 рассекают эндонуклеазами Sail и Bgl 31, добавляют Xho I линкер и полученную смесь обрабатывают ДНК-лигазой Т4, у полученных плазмид определяют нукле- отидную последовательность и выбираю плазмиды рАИ до +2, рАМ от 82 до -33, рАМ 83 до -50 и рАМ 83 до -51, из которых удалена часть гена РбО.

3,Способ по п. 1, отличающийся тем, ЧТО плазмы крови больных гепатитом В выделяют ДНК вирса, однонитьевую ДНК удваивают с помощью ДНК-полимеразы 1,полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазой Xho 1 и клонируют в Xho 1 сайт ДНК / -фага Шарон 15А, выделенные гибридтиза цией с меченной ДНК вируса гепатита В, ДНК фагов и пл-азми- ду рАСУС/77 обрабатывают Xho 1 эндонуклеазой, полученньш фрагменты сшивают ДНК-лигазой Т4, далее трансформруют полученным рекомбинантными ДНК клетки E.coli и отбирают рекомбинаит ную плазмиду рНР4, содержащую ген HBsAg

рАН 205 5.548

ч138787812

Продолжение таблицы

Этот носитель не содержит ни гена Bt B, ни гена HBS и используется в качестве отрицательного контрольного клона (отрицательный контрольный клон с использованием устройства РИА имеет активность в 310 отсчетов/ мин, а положительный контрольный клон имеет тот же показатель в 17500 отсчетов/мин.

рА 101 П.200