Способ получения субъединичной вакцины вируса простого лишая Советский патент 1990 года по МПК A61K39/12 A61K47/00 

1

(21)3786918/30-13

(22)30.08.84

(31)159641

(32)31.08.83

(33)JP

(46) 30.05.90. Кюл. № 12

(71)Джуридикап Фаундейшн Дзе Кемо- Серо-Терапевтик Рисерч Институт (JP)

(72)Еитиро Кино и Нобуя Охтомо (JP) (53) 615.372 (088.8)

(56) The Human Heroes Viruses. Ed. by Nahraias et al. Elsevier. New York, 1981, p.p. 503-509,

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЯЬЕДИНИЧНОЙ ВАКЦИНЫ ВИРУСА ПРОСТОГО ЛИШАЯ (57) Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в производстве вакцинных препаратов. Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта и унификация вакдионного препарата. Для приготовления вакцины используют гликопро- теин gB, выделенный из клеток, предварительно зараженных вирусом простого лишая (ВИЛ): гликопротеин очищают методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител против р,Б. Гель с адсорбированными антителами уравновешивают фосфатным буфером рН 7,2-7,4, содержащим 0,05 об.% простого полиокси- этиленоктилфенилового эфира. После адсорбции gB гель промывают тем же буфером и элюируют гликопротеин раст вором, содержащим ЗМ раствор тио- циаиата калия и 0,05 об,7, простого полиоксиэтиленоктилфенилового эфира. Полученный очищенный препарат gB диализуют против фосфатного буфера и адсорбируют на гидроксиде алюминия. Вакцину можно лиофилизировать, она зффективна против- ВПЛ I и TI типа.

о

(Л

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в производстве вакцинных препаратов. Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта и унификация вакцинного препарата. Для приготовления вакцины используют гликопротеин дВ, выделенный из клеток, предварительно зараженных вирусом простого лишая (ВПЛ): гликопротеин очищают методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител против дВ. Гель с адсорбированными антителами уравновешивают фосфатным буфером PH 7,2 - 7,4, содержащим 0,05 об. % простого полиоксиэтиленоктилфенилового эфира. После адсорбции дВ гель промывают тем же буфером и элюируют гликопротеин раствором, содержащим ЗМ раствор тиоцианата калия и 0,05 об.% простого полиоксиэтиленоктилфенилового эфира. Полученный очищенный препарат дВ диализуют против фосфатного буфера и адсорбируют на гидроксиде алюминия. Вакцину можно лиофилизировать, она эффективна против ВПЛ 1 и П типа.

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в производстве вакцинных препаратов.

Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта и унификация вакцинного препарата,

Пример 1. Приготовление моно- клонального антитела.

Клетки Veto, зараженные KOS- гатаммом вируса простого лишая (ВПЛ) типа I, через 24 ч после заражения растворяют в фосфатном буферном растворе рН 7,2-7,4, содержащем 1 об/оГ.% простого полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (тритона Х-100), прг 4° (. в течение 1 ч. Полученный раствор центрифугируют в течение 1 ч при 100 тыс. g и собирают супернатант, представляющий собой фракцию сырого гликопротеина 0,1 мл этой фракции (содержание протеина 100 мг/мл), вводят внутрикожно в заднюю лапу 4-недельным самкам МЫШРЙ линии BALB/C. Через месяц после иммунизации у животных извлекают селезенку, нарезают ее на тонкие ломтики и суспендируют в среде Игла MEM. Полученную суспензию клеток в концептсл

СП

Јь

-s|

СЛ

сл

см

рации 10 кл/мл и отдельно приготовленную суспензию клеток РЗИ1 в концентрации кл/мл сливают в пробирку и добавляют полиэтиленгли - коль м.в. 4000. Реакцию слияния клеток проводят при 37 С в течение 5 мин. Полученные гибриды клеток суспендируют в среде ГАТ, отбирая гибрид, способный продуцировать анти тела к gB. Отобранный гибрид вводят внутрибрюшинно 4-недельным самкам - мышей линии BALB/c обработанным 2,6-,-10, 14-тетраметилпентадеканом. Через 7-14 дней после введения от- бирают асцитическую жидкость и получают моноклональное антитело (монАТ) специфичное к gB (количество IgG 10 мг/мл).

Пример 2. Приготовление адсо бента, связанного с монАТ,

К полученной по примеру 1 асци- тической жидкости, содержащей монАТ добавляют при 4°Ј 50%-ный раствор сульфата аммония - для осаждения IgG-фракции. Осадок иммуноглобулинов растворяют в буферном растворе, содержащем 0,05 М NaHCOs и 0,15 М NaCl pH 8,2.

Полученный раствор подвергают диализу против того же буферного раствора при 4°С в течение 24 ч, после чего связывают его с активированной CNBr сефарозой 4В в концентрации 5 мг/мл. Получают связанный с МрнАТ адсорбент.

Очистка дВ с помощью иммусорбента Клетки Vero заражают ВПЛ типа I (КО-гатамм), через 24 ч собирают зараженные клетки, растворяют их в фосфатно-буферном растворе рН 7,2- 7,4, содержащем 0,05 об/об% тритона Х-100, и пропускают через колонку, заполненную иммуносорбентом. Колонку промывают тем же буферным раствором. Адсорбированный gB элюируют ЗМ раствором KSCN, содержащим 0,05 об/об% тритона Х-100, диализую против того же буфера и концентрируют ультрафильтрацией. Все операции проводят при

4°С.

Очищенный gB подвергают электро- форетическому анализу с использованием SDS-полиакриламидного геля. Основная полоса gB обнаруживается примерно при 90К.

П р и м е р 3. Получение вакцины ня очищенного gB,

0

5

Раствор очищенного gB в фосфатно- буферном растворе рН 7,2-7,4 с 0,05 об/об% тритона Х-100, содержащий 30 мкг/мл протеина, смешивают с водным раствором хлористого алюминия (в пересчете на гидрооксид алюминия - в 8-кратном i.- по весу избытке по сравнению с весом протеина gB). рН смеси доводят 1н раствором NaOH до 6,7. Получают гель гидроксида алюминия с адсорбировавшимся протеином gB. Полученный продукт центрифугируют, осадок диспергируют -в исходном буфере с таким расчетом, чтобы концентрация gB составляла 30 мкг/мл. К препарату добавляют тимерсал в количестве 0,01 вес./об.%. Смесь разливают объемом 2 мл по 1 мл в каждую, ампулы запаивают. В процессе хранения вакцины выпадает белый туманообразный осадок, при легком встряхивании образуется однородная белая суспензия.

Пример 4. Получение лиофили- эированной вакцины.

Осадок алюминиевого геля с адсорбированным gB, полученный по примеру 3, диспергируют в физиологическом растворе (рН 7,2-7,4), содержащем 10 вес./об.% лактозы, 0,4 вес./об.% L-глутамината натрия, 0,4 вес./об.% аргинина, Ов8 вес,/об.% желатина и .0,05 вес./об.% тимерсала, концентра- ция протеина 30 мкг/мл. Вакцину с наполнителем разливают по 1 мл в ампулы емкостью 2 мл и лиофилиэи- руют по схеме: предварительная лио- филизация при -50°С и атмосферном давлении в течение 6 ч, затем первая

лиофилизация при +5 С при пониженном давлении (0,04 Тбрр) в течение 15 мин и вторая лиофилизация при при пониженном давлении (0,05 Торр) в течение 8ч. Получают лиофилизиро- ванную вакцину.

При испытании адсорбированной вакцины и адсорбированной - лиофилиэи- рованной вакцины на лабораторных животных установлено, что вакцины ареактогенны, нетоксичны и иммуно- генны. Вакцина независимо от формы проявляет высокий защитный эффект 100%-ная выживаемость животных) в отношении как ВПЛ I типа, так и ВПЛ П.типа. Формула изобретения

Способ получения субъединичной вакцины вируса простого лишая, вклю-

чающий очистку раствора, содержащего гликопротеины вируса простого лишая, с помощью аффинной хроматографии с последующей адсорбцией целевого продукта на алюмогеле, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта и унификации вакцинного препарата, аффинную хроматографию осуществляют путем пропускания раствора через гель, связанный с моноклональным антителом, специфичным к гликопро- теину gB, и уравновешенный фосфатным

буфером-рН 7,2-7,4, содержащим 0,05 об.% простого полиоксиэтилен- октилфенилового эфира, промывку геля с абсорбатом осуществляют тем же буфером и элюируют целевой продукт элюирующим раствором, содержащим ЗМ-раствор тиоцианата калия и 0,05 об,% простого полиоксиэтилен- октилфенилового эфира, а перед адсорбцией на алюмогеле целевой продукт диалйзуют против буфера, используемого для аффинной хроматографии.