Способ оценки кинетики клеточных популяций IN VIтRо Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к биологии в частности к изучению культивируемых клеточных культур.

Цель изобретения - упрощение сПо- соба и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям.

Увеличение информативности и уп- рощения способа достигается за счет того, что исследуемую клеточную популяцию периодически фракционируют, извлекая в результате встряхивания нитотические клетки в виде фракций, в которых определяют концентрацию клеток и их радиоактивность, по результатам этих измерений строят кривые изменения количества клеток и удельной радиоактивности от времени, по которым определяют продолжитель- ность пренитотической Gj, синтетической S и пресинтетической 0 стадий клеточного цикла, распределение клеток ростовой фракции по этим стадиям и распределение клеток ,на протяжении этих стадий.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Используют две

культуры фиброб ластоподобных клеток линий ФЭЧ-Л22 и ЧЭЧ-Л23. Клетки суб- культивируют на протяжении 2 пассажей. Пересев клеток осуществляют стан дартнь1М способом, с использованием ctaндapтныx питательных сред. В экспериментальные матрицы засевают 3,410 клеток/матрац. Взяты 1 матра с культурой ФЭЧ-Л22 и 1 матрац с културой ФЭЧ-Л23. Этап предфракционного культивирования составляет 23 ч. За 1 ч до начала фракционирования питательную среду в экспериментальных флаконах заменяют на среду того же состава, содержащую Н-тимидин (5 мКи/мл). Культуры клеток инкубируют в этой среде 60 мин при 37 С, от- мь1вают от невключившегося предшественника ДНК тремя объемами свежей питательной среды и вновь добавляют 45 мл питательной среды. В качестве среды для фракционирования используют среду стандартного состава. Этап фракционирования проводят по одночасовому циклу. Режим культивирования состав ляет 50 мин, режим фракционирования 10 мин. За время эксперимента было собрано 29 фракций клеток.

0

5

Результаты приведены в табл.1 и 2.

На фиг.1 и 2 представлены М- и S-профили культур ФЭЧ-Л23 ФЭЧ-Л22 соответственно.

Результаты расчетов промежуточных величин для оценки параметров продолжительности стадий клеточного цикла приведены в табл.3 и обозначены стрелками на фиг.1 и 2. Данные для оценки параметров распределения клеток ростовой фракции по стад,иям клеточного цикла и для определения распределения клеток культуры в кажд.ой стадии цикла представлены в табл.1 и 2 (столбец 9).

Значения кинетических параметров для исследуемых культур приведены в табл.4.

Пример 2. Вычисление исходных величин.

Исходными данными для расчета кинетических параметров являются характеристики митотического профиля (М-профиля), представляющего собой кривую, описывающую изменение количества клеток популяции, вступающих в митоз в зависимости от времени получения фракции, и S-профиля, который описывает изменение интен- сивности включения радиоактивного предщественника ДНК (удельной радиоактивности) от времени получения фракции. В табл.1 приведены данные для построения М- и S-профилей. Для выполнения расчетов параметров продолжительности стадий клеточного цикла количественньй выход клеток и данные удельной рад,иоактивности преобразовывают по методу скользящего среднего. Кривые М- и S-профиля строят по данным, приведенным в столбцах 7 и 8 (табл.1).

Процедура оценки кинетических параметров (фиг,1) заключается в следующем .

Из кривой, описывающей М-профиль, видно, что она представлена тремя пиками. Первый пик имеет максимум в точке 2 ч и минимум в точке, соответствующей 3 ч фракционирования. Второй пик имеет максимум, приходящийся .на 5 ч и два минимума в точках 3 и 10 ч. Третий пик имеет максимум в точке 16 ч и два минимума в точках 10 и 22 ч.

Кривая S-профиля представлена двумя пиками, которые описываются

максимумами в мумами в точках симумом в точке вующими минимума

точке

Itoll

31

8 I и мини- и 16 ч и мак- 26 ч с соответст- в точках 16 и

29 ч. Для вычисления параметров Тд , Тд и Tq необходимо определить начало и окончание выхода клеток, находящихся в GJ, S и G, периодах клеточного цикла (что соответствует пер вому, второму и третьему пикам мито- тического профиля). Для определения интервалов времени, соответствующих вхождению в митоз Gj, S и G субпрпуляций клеток, кривые М- и S-npo- филей аппроксимировали кусочно-линейными функциями. В общем виде эта процедура состоит в описании каждого пика М- и S-профилей двумя линейными функциями:

t

t

а .

а .

(1) (2)

где - коэффициент регрессии, характеризующий восходящую часть пика; t - время, в течение которого

переменная у увеличивается f - коэффициент регрессии, рактеризунмций нисходящую часть пика}

t - время, в течение которого переменная у уменьщается. Приравнивая значения у и у нулю находим точки начала и окончания пика. На фиг.1 рассмотрим второй пик кривой М-профиля (интервал между 3 и 10 часами фракционирования). Восходящая часть пика начинается в точке, соответствуклдей 3 ч и продолжается в течение двух последующих часов, описывается выражением, которое является преобразованием уравнения (1) по данным примера (табл.1, столбец 7, 3-5 фракции):

у 100,5 ts - 183,3.

(3)

Нисходящая часть пика приходится на 5-10 ч фракционирования и описывается следующим выражением (на основе уравнения 2 и упомянутого примера) :

у -62,8 t + 611,1,

(4)

ts начало выхода клеток дии клеточного цикла

S ста- в митоз, определяемое по М-про- филю}

- окончание выхода клеток S- стадии клеточного цикла в митоз, определяемое по М- профилю. Приравнивая у и у к нулю получаем оценки

1,82

(5)

iMIjLl 9 73 -м и -62,8

(6)

Подобным образом вычисляются и другие промежуточные величины, необходимые для определения продолжитель- Q ности (Тд, Tg, TO,) стадий клеточного цикла. Ниже указаны условные обозначения и определения этих величин М-профиль:

tq - начало выхода клеток G

5 стадии в митоз

t

Сг стадии

Q,

-окончание выхода клеток G в митоз;

-начало выхода клеток G

0

5

стадии в митоз;

t-Q - окончание выхода клеток G, стадии в митозJ профиль;

начало выхода клеток S стадии в митоз;

t, - окончание выхода клеток S стадии в митоз;

S - начало выхода в митоз клеток.

прошедших второй цикл,

Расчеты t

Л -«

по S-профилю

40

выполняют с использованием:уравнений (1) и (2). Получив оценки девяти ве- личин(tЦ, t, t;, t4 . t, , , , t, t j t ), определяют продолжительность периодов клеточного цикла 45 по следующим формулам.

Пример 3. Оценка параметров продолжительности стадий клеточного цикла.

Продолжительность G ст.адии

50

т,,).

(7)

(В)

G стадии, tg не определяют.

первый пик М-профиля имеет

только нисходящую часть (фиг.1). В

этом случае за начало G периода принимают начало фракционирования,т.е. нулевая точка.

Продолжительность S стадии

2

(Т) (9)

-

L

+ ts

2

(10)

т т - Т

S

-начало S стадии}

-окончание S стадии.

(11)

де Тд

грН

s Продолжительность G

гр ,

Т,tLi-tl

2

стадии (1 ). (12)

.

т: - т

Q,

;i3)

(14)

где

т

Т

М1

-начало G, периода;

-окончание G;, стадии. Вычисленные значения промежуточных

величин приведены в табл.3.

Оцененные параметры Т(

LQ, ig, Iq

приведены в табл.А.

П р и м е р 4. Оценка параметров, характеризующих распределение клеток ростовой фракции по стадиям клеточного цикла

Nc,,N5,Nq,

).

Для определения количества клеток находящихся в кажд,ой ст адии клеточного цикла, используют вычисленные вьше оценки продолжительности каждой стадии клеточного цикла. Подсчет кле- ток, находившихся в каждой стадии цикла, проводят путем суммирования количества клеток, полученных во фракциях за период соответствующей стадии клеточного цикла (Т, Тд, Tq,). Для культуры ФЭЧ-Л22 продолжительность стадии Gj составила (1,1- 6,4 ч (табл.4). Суммируя количество клеток, полученных в первых шести часовых фракциях и прибавляя клетки, полученные за 0,4 часа седьмой фракции, получим за время G2 стадии в митоз вошло 1465,6x10 клеток (табл.2, столбец 9). Аналогичным путем вычисляют оценки количества клеток других стадий клеточного цикла (Ng и N,5). Таким образом, структура ростовой фракции исследуемой популяции клеток

.состоит, из 34,7% N, 44,1% N5,

U511646

13% NQ и 8,2% клеток, прошедших второй цикл.

Пример 5. Оценка параметров, отражающих распределение клеток популяции в каждой стадии клеточного

цикла (Рч, 5 ,

В общем виде эти параметры вычисляются по формуле для коэффициента линейной регрессии

.(t..- t)(logy; - logy)

1 el

(t, - 1)2

(15)

0

t; y

5

Q

где К - номер последней фракции клеток соответствующей стадии клеточного цикла, время получения фракций клеток соответствующей стадии клеточного цикла, количество клеток соответствующей стадии клеточного цикла, полученное к моменту времени t. Например (табл.2, столб. 9), для культуры ФЭЧ-Л22 t; Тц, 1,1 ч, t.Tc 6,4ч. Количество клеток за это время увеличилось с у{ 0 208, до УК 1465,6x10 клеток. Вычисленное по формуле (15) значение А с составляет 0,0012.

Таким образом, используя предлагаемый метод, в одном эксперименте 5 получены три группы параметров. Эти параметры характеризуют продолжительность стадий клеточного цикла, распределение клеток популяции по этим стадиям и распределение клеток внутри каждой стадии цикла.

Формула из обретения

Способ оценки кинетики клеточных популяций in vitro путем импульсного инкубирования с радиоактивным предше- ственником ДНК с последунщей оценкой кинетических параметроб, отличающийся тем, что, с целью, упрощения способа и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям, исследуемую клеточную популяцию периодически фракционируют, извлекая в результате встряхивания митотические клетки в виде фракций, в которых определяют концентрацию клеток и их радиоактивность, по результатам этих из

U511648

мерений вычисляют удельную радиоак-тетической S и пресинтетической G,

тивность, строят кривые изменениястадий клеточного цикла, распредеколичества клеток и удельной радио-ление клеток ростовой фракции по G,,

активности от времени фракционирова- S и G, стадиям и распределение кления, по которым определяют продол-ток на протяжении G., S и G. стадий

жительность премитотической G, сии-клеточного цикла.

Изобретение относится к биологии, в частности к изучению культивируемых клеточных культур. Целью изобретения явдяется упрощение способа и одновременной оценки продолжительности стадий клеточного цикла и распределения клеток популяций по этим стадиям. Изобретение позволяет получить оценки продолжительности премитотической и синтетической фазы митотического цикла и распределения клеток популяции по этим фазам. Оценки получают при исследовании клеточной культуры, выращиваемой в одной матрице, Монослойно культивируемые клетки импульсно инкубируют с радио-, активным предшественником ДНК. Культур альный матрац помещают в аппарат фракционирования и соединяют трубками с питательной средой, с коллек- тором фракций (КФ) и с коллектором клеток для инкубации с флуоресцент- ньм красителем (КК). Клетки вступившие в митоз, фракционируют из популяции периодическим встряхиванием. Каждьй раз часть получаемой фракции перекачивают в КФ и.осаявда- ют на фильтры для последующего определения радиоактивности. Вторую половину сливают в КК, окрашивают и прокачивают через камеру для проточного счета люминесцентного микроскопа. В матрац закачивают свежую питательную среду и через определенное время повторяют всю процедуру. По отношению радиоактивности каждой фракции к количеству клеток этой фракции определяют интенсивность синтеза ДНК (ИС). В результате по НС и времени получения фракций определяют продолжительность синтетической фазы, а затем продолжительность премитотической фазы. По количеству клеток во фракциях, полученных за время каждой фазы, оценивают распределение клеток популяции. 2 ил., 4 табл. сл О5 4

Таблица 1

11

1451164

12 Продолжение табл. 2

Культура

Параметры, ч

kZ Zl LlIiIl EZAn n lZ

ФЭЧ-Л22 1,11 9,7 5,16 15,6 7,83 20,98 2,62 17,25 15,95 ФЭЧ-Л23 - 3,64 1,82 9,73 10,12 21,7 0,68 15,48 16,32

Т а б л и ц а 4

5,3 (1,1-6,4)2,2 (0-2,2)

12,5 (3,9-16,4)11,3 (1,3-12,6)

5,5 (12,04-18,5)6,3 (12,8-19,0)

1465,6 (34,7%)793,2 (23,5%)

1864,5 (44,1%1295,7 (38,4%)

550,9 (13,0%)1014,3 (39,

Примеча, ние. В скобках время началами окончания

стадии клеточного цикла.

Параметры, ч

I

fUI30 ffT}Ulf/ Oor)V(i tfDHH/dffi

Й

u

lr

yitniiHDdcb og мошзия osui:)3hTii/Q

u

lr

gu4JOHffniU)ivoiigvd

X

OS ) )

J;

a

Й

ts 5Г

,l