J
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики и исследования патологических состояний..
Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гликопротеиду базальных мембран знтактину.
Штамм получают следующим образом.
В качестве антигена Используют частично очищенный препарат ламинина из мышиной опухоли EHS, в котором энтактин присутствует в виде примеси. Схема иммунизации: крысы линии Фишер получают 4 инъекции по 150 мкг белка каждая. Первая инъекция - внутрибрю .
шинно в полном адьюванте Фрейнда, через 1 месяц - две внутрибргапинных инъекции в неполном адьюванте Фрейнда с интервалом 10 дней между инъекция-, ми, через 10 дней - внутривенная инъекция без адьюванта (в переднюю к амеру глаза). Объем раствора антигена 0,15 мл, адьювант добавляют в равном . Гибридизацию проводят на 4 день после 4-й иммунизации. Дпя этого клетки селезенки иммунных крыс (ЮЪ гибридизуют с 5-10 клеток мышиной миеломы X63-Ag 8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. мае. 1500. Культивирование гибридных клеток ведут в 96-луночных платах на предварительно посаженных перитонеальных макрофагах мыши .(5-8
ел
00 00 00
ел
lO клеток на лунку). Питательная среда: среда Игла в модификации Дуль- бекко (даЕМ) с 20% эмбриональной телячьей сыворотки или 10% эмбрио- с нальиой телячьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, мМ пирувата, гипоксантина, аминопте- рина и 1,6-10-- М тимидина, 100 ед/мл гентамицина. Гибридомы клонируют 10 2 раза, высевая на лунку .с макрофагами по 1 клетке. Отбор клонов осуществляют иммунофлуоресцентным окрашиХарактеристика полезного продук МКА относятся к классу 1 g Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран э тактином. Метод оценки сохранения специфичности: непрямая иммунофлуоI ванием криостатных срезов почки мьши. Из 500 проверенных клонов культураль- 15 ресценция (окрашиваются базальные ная жидкость (КЖ) одного из них pea- мембраны на срезах) и радиоиммуно- гирует в иммунофлуоресценции с базапь преципитация.: антитела связывают с ными мембранами почки, причем,особен- но сильно с базалый1ми мембранами
сефарозой с пришить1ми иммуноглобули нами кролика против иммyнoг loбyлинo
20
нрысы, инкубируют с меченным аминокислотами или I - лизатом мьшиной тератобластомы ТБ-24 или мышиной опухоли EHS, преципитат подвергают электрофорезу в градиентном полиакклубочковых капилляров. В-радиоимму- нопреципитационном тесте с лизатом мышиной тератобластомы ТБ 24 КЖ этого клона реагирует с сульфатированным гликопротеидом энтактином (мол. мае.
150 кД). Данный клон выводят в массо-25 риламидном геле (5-15/5) в присутствую культуру и обозначают ЗАМ. Штамм и додецилсульфата натрия и высу- хранится в Специализированной кол- шенныи гель подвергают авторадиогра- лекции перевиваемых соматических кле- фии. Положительная реакция проявляет- ток позвоночных Всесоюзной коллекции присутствием на автографах меченой клеточных культур (Институт цитоло- 30 полосы 150 КД.
гии АН СССР) под номером ВСКК (П) Контаминация. Бактерии и грибы 124 D. н культуре не обнаружены при длительЫтамм характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки.
Среда культивирования - среда . ресуспендируют в эмбриональной Игла в модификации Дульбекко (ДНЕМ) телячьей сыворотке, содержащей 10% с 0% эмбриональной телячьей сыворот- диметилсульфоксида, и концентрации ки (или 10% эмбриональной телячьей 1-3-10 клеток в 1 мл, разливают в сыворотки и 10% лошадиной сыворотки), 40 стерильные пластиковые ампулы при 1 мМ глутамина, 100 ед. гентамицина в 1 мл. Клетки выращивают при 37°С и 5% углекислоты в атмосфере. Дця выращивания штамма можно использо45
ном наблюдении и посевах на питательные среды. 25 Криоконсервирование. Клетки штамвать стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон объемом 25 см в 5 мл среды засевают 2-5-10 клето.к ЗАМ. Пассаж - 1 раз в 4-5 дней той же дозой клеток. Без подсчета клеток - 1:3. Культивирование in vivo. Так как гибридома получена при слиянии клеток крысы и мыши, культивирование in vivo в обычных животных невозможно.
Кариологические признаки.
Модальное число хромосом - 86 (в 50% метафаз двойные микрохромосомы). Продуктивность штамма.
и за,мораживают-в ;кидком азоте по программе со снижением температуры на в минуту с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание: 1 мин. при . Клетки разводят в 5-10 мл полной среды, центрифугируют при комнатной температуре
5мин при 1000 об/мин,, сливают.среду, заливают 1 мл свежей среды и пеgQ реносят в лунку 24-луночной платы с предварительно посаг-сенными перито- неальными макрофагами мьши (25-40 1-10 клеток на лунку). Жизнеспособность клеток по включению трипаиового
gg синего составляе г 50-90%.
Пример. Кусочки почки, полученной от свежезабитой мыши, помещают в 7%-ный раствор желатина в а- буференном физрастворе (ЗФР) и неСекреция МКА на 5-й день культивирования составляет 10-20 мкг/мл куль- туральиой жидкости. Стабильная секреция продукта сохра}иется до 35 пассажей в куль туре. При регуллрном тестировании не отмечено снижения выработки антител.
Характеристика полезного продукта МКА относятся к классу 1 g (H) Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран эн- тактином. Метод оценки сохранения специфичности: непрямая иммунофлуоресценция (окрашиваются базальные мембраны на срезах) и радиоиммуно- преципитация.: антитела связывают с
ресценция (окрашиваются базальные мембраны на срезах) и радиоиммуно- преципитация.: антитела связывают с
сефарозой с пришить1ми иммуноглобулинами кролика против иммyнoг loбyлинoв
нрысы, инкубируют с меченным аминокислотами или I - лизатом мьшиной тератобластомы ТБ-24 или мышиной опухоли EHS, преципитат подвергают электрофорезу в градиентном полиак . ресуспендируют в эмбриональной телячьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида, и концентрации 1-3-10 клеток в 1 мл, разливают в 40 стерильные пластиковые ампулы при
ном наблюдении и посевах на питательные среды. 25 Криоконсервирование. Клетки штам. ресуспендируют в эмбриональной телячьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида, и концентрации 1-3-10 клеток в 1 мл, разливают в 0 стерильные пластиковые ампулы при
5
и за,мораживают-в ;кидком азоте по программе со снижением температуры на в минуту с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание: 1 мин. при . Клетки разводят в 5-10 мл полной среды, центрифугируют при комнатной температуре
5мин при 1000 об/мин,, сливают.среду, заливают 1 мл свежей среды и пеQ реносят в лунку 24-луночной платы с предварительно посаг-сенными перито- неальными макрофагами мьши (25-40 1-10 клеток на лунку). Жизнеспособность клеток по включению трипаиового
g синего составляе г 50-90%.
Пример. Кусочки почки, полученной от свежезабитой мыши, помещают в 7%-ный раствор желатина в а- буференном физрастворе (ЗФР) и немедленно замораживают в жидком азоте Блоки хранят при -70°С. Срезы толщиной 5 мкм готовят на криотоме, фиксируют 5 мин в 10%-ном формалине и тщательно отмывают в ЭФР. Далее ставят реакцию непрямой иммунофлуоресценцйи при комнатной температуре. Первая инкубация (I ч) - КЖ клеток штамма ЗАМ. После отмывки в ЗФР - вторая ин- кубация (1 ч) - кроличья антисыворотка ,к иммуноглобулинам крысы, меченная флуоресцеинизотиоцианатом в разведении I:20 после предварительного истощения сыворотки печеночным порошком мыши. Отмытые в ЗФР заключают ,в глицерин на ЗФР (1:1), Контроль - первая инкубация с ЗФР вместо МКА,
Препарат исследуют в микроскопе с флуоресцентной приставкой. Отмечают свечение базальных мембран почки. Особенно ярко окрашены базальные мембраны клубочковых капилляров. Клетки канальцев, эндотелий сосудов, строма не окрашены, следовательно, не содержат энтактина. Таким образом, полученные МКА специфически выявляют гликопротеид базальных мембран энтак
тин и не взаимодействуют с другими белками клетки.
П р и м е р 2. Отмытые ,в ЗФР эмб- риоидные тельца тератобластомы ТБ-24 заливают в желатин и сразу же замораживают в жидкой азоте. материал обрабатывают, как описано в примере 1, и исследуют в микроскопе с флуоресцентной приставкой. Отмечают положительную реакцию с. матриксом внутри змбриовдного тельца ТБ-24. Окраска фибриллярная. Скопления клеток в ч матриксе не окраше ны, следовательно, не содержат внутриклеточного энтактина .
Таким образом, полученные МКА дают возможность детально исследовать изменение базальных мембран в экспериментальных опухолях животных в пропл - цессе инвазии И метаста.зирования.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых 25 клеток животных Rattus norvegicus
ВСКК (П) 124D, используемый для получения моноклональных антител к гли- копротеиду базальных мембран энтакт тину.
Изобретение.относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики и исследования патологических состояний. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Rattus norvegicus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гликопротеиду базальных мембран энтакти ну. Штамм получают гибрид из ацией спленоцитов крысы, иммунизированных препаратом ламинина из мьш1иной опухоли, с клетками мьпииной миеломы X 8.653. Продукция МКА на 5-й день культивирования составляет 10- 20 мкг/мл. МКА относятся к классу Ig G у 2 а(Н)., Они специфически взаимодействуют с гликопротеидом базальных мембран ламинином м.м. 150 kD. Штамм культивируют на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, модальное число хромосом в клетках штамма 86. I (Л
Редактор А. Лежнина
Составитель М. Серова
Техред М.Дндык Корректор М. Демчи
Заказ 326/29
Тираж 500
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Подписное
