Способ определения жизнеспособности микроорганизмов Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/00 C12M1/34 

I

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технике бактериологического анализа.

Цель изобретения - повьшение точности и достоверности определения за счет стабилизации условий роста колоний.

Сущность способа заключается в том, что в процессе культивирования микроорганизмов осуществляют снятие возникающего электрического заряда с плотной питательной среды с нанесенной на ее поверхность суспензией микроорганизмов.

Чашки Петри с плотной питательной средой с нанесенной на ее поверхность суспензией микроорганизмов зак рывают стерильными крьшхками, изготовленными из электропроводного материала, так, чтобы был электрический контакт между питательной средой и крьшками, через которые осуществляется заземление питательных сред с нанесенными микроорганизмами.

Засеянные и закрытые крышками чашки помещают в термостат при необ- . ходимой температуре на 16-48 ч с сохранением заземления плотной питательной среды, засеянной микроорганизмами, на все время инкубации. Таким образом создается возможность для оттока возникающего электричес ел

00 00 00

со

коро заряда от микробных клеток на протяжении всего времени образования колоний вплоть до подсчета их количества. Непосредственно подсче колоний производится обычным образом без осложнений, так как чашка, в которой находится плотная питательная среда с выросшими колониями, изготовпрозрачна для света. Приспособление для создания возможности заземления гтотной питательной среды, разлитой в стеклянные чашки Петри,, состоит из крьш1ки со штырем, изготовленных из электропроводного материала, преимущественно нержавеющей стали. На заземленный металлический поддоц помещают после засева чашки, закрытые металлическими крьш1ками. Через штырь крьппки, который касается плотной питательной среды с нанесенными на нее микроорганизмами, корпус крьш1ки и металлический поддон осуществляется заземление Плотной питательной среды.

Пример 1, Кульууру E,coli М-17, .выращенную на глюкозо-шнераль ной среде до концентрации высевают на среду Эндо, Для высева производят последовательно .7 десятикратных разведений исходной суспензии в стерильном физиологическом растворе NaCl. 0,1 мл суспензии из седьмого по счету разведения пипеткой наносят на поверхность плотной питательной среды в каждую из двадцати чашек Петри, суспензию равномерно распределяют по поверхности агара шпателем, 10 чашек закрывают обычными стеклянными крышками, а другие 10 чашек - металлическими крьш1ками. Закрытые металлическими крьш1ками чяшки помещают на заземленный металлический поддон так, чтобы был контакт каждой из металлических крьш1ек с поддоном, и последний помещают в термостат при . В этот же термостат помещают засеянные чашки Петри, закрытые стеклянными крышками. Через 24 ч производят подсчет выросших колоний,

В табл,1 приведены результаты количественных высевов культуры клеток E,coli М-17 без снятия (N) и со снятием (NC) статического электричества

Пример 2, Суточную культуру Pseudomonas maltophilia ССЕВ 715, выращенную на плотной питательной

среде (сухом питательном агаре), смывают стерильным физиологическим раствором NaCl, Полученную суспензию клеток подвергают последовательным десятикратным разведениям и 0,1 мл суспензии из последнего разведения наносят на поверхность плотной питательной средь (сухой . пита0 тельный агар) в каждую из двадцати чашек. Петри, Суспензию равномерно распределяют по поверхности агара . шпателем, 10 чашек закрывают обычны- ;ми стеклянными крьш1ками., а другие

5 10 чашек - металлическими крьш1ками. Закрытые металлическими крьш1ками чашки помещают на заземлённый металлический поддон так, чтобы был кон-, такт каждой из металлических крьш1ек

0 с поддоном, и последний помещают в термостат при 37°С, В этот же термостат помещают засеянные чашки Петри, закрытые стеклянными крьшками, Че рез 24 ч производят подсчет вырос75 пих колоний,

в .табл,2 приведены результаты количественных высевов культуры клеток PS, maltophilia ССЕВ 715 без снятия (Н)и со снятием (Ы,)стати30 ческого электричества.

П р и м е р 3, Суспензию .клеток E,aerogenes, приготовленную и разведенную в стерильном физиологическом растворе NaCl как описано в примере 2, в объеме 0,1 мл наносят на поверхность плотной питательной среды, разлитой в чашки Петр)и, После равномерного распределения суспензии по поверхности агара 10 засеянных чашек Петри закрывают обычными стеклянными крьш1ками, а другие 10 чашек с нанесенной суспензией - металлическими крьш1ками. Закрытые -металлически- ми крьш1ками чашки помещают на заземленный металлический поддон так, чтобы был контакт каждой из металлических крьш1екс поддоном, и последний помещают в термостат при 37°С, В этот же термостат помещают засеянные ч аш ки Пе три, з акрыты ест екл я нными крьш1ками. Через 30 ч производят подсчет выросших колоний,

В табЛоЗ даны результаты количественных высевов культуры клеток, Е, aerogenea без снятия (N) и со снятием (N,) .статического электричества,

П р и м е р 4. Суспензию клеток ры PS .aeruginosa 889, приготовленную и

разведенную как описано в примере 2, засевают в 20 чашек Петри на поверхность плотной питательной среды, 10 чашек Пйтри закрывают обычными стекгг лянными крышками, а другие 10 - металлическими крьш1ками. Закрытые металлическими крьш1ками чашки помеща.- ют на заземленный металлический поддон, так чтобы бьт контакт каждой из металлических крышек с поддоном, и последний помещают в термостат при 37°С. В этот же термостат помещают засеянные чашки Петри, закрытые стеклянными , крьш1ками. Через 24 ч производят подсчет выросших колоний,

В табл.4 приведены результаты количественных высевов культуры клеток Ре. aeruginosa 889 без снятия (N) и со снятием (NQ) статического электричества.

Таким образом, использование предг лагаемого способа улучшает точностные параметры, характеризуюнсие разб- рос результатов, более, чем в 2 раза. Для E,coli М-17, например относительная погрешность 1о 5,8% (при доверительной вероятности р 0,95) по сравнению с относительной погреш-

Z 16,2% (при р

0,95)

ностью

для известного.

Кроме того, абсолютные количества подсчитанных колоний в примерах с использованием заземленных питательных сред оказались на 10-155S выше, т.е, систематическая погрешность,: обусловленная гибелью ослабленных клеток при переносе их на плотные питательные среды при снятии заряда (т,е, предлагаемым способом) уменьшается.

15 Формула изобретения

Способ определения жизнеспособности микроорганизмов, предусматри- ваю1ций нанесение проб сурпензий микг роорганизмов на плотную питательную среду, помещенную в чашки Петри, культивирование в термостатируемых условиях с последующим подсчетом выросших колоний, отличающий- с я тем, что, с целью повьшения точности и достоверности определения за счет стабилизации условий роста колоний, питательную,среду в процессе культивирования заземляют.

0

5

Т а б л и ц а 1

/

-a-..

, ° 2,3 -451

к A3,о

Ь (Р 0,95)

1:А.%.шо%

.(р 0,68)

-1.100% 1А,

- i - -100% 7,0%

9,3

Ш

2,3-d So 21,2

-к--100% 6,7%

R

(р 0,95)

W, 4..100%

(р 0,68)

3,2%

dN| 2,3 3Sk 43,5 Е. 36,9% (р ;0.95)

W 17,6% (р 0,68)

/5Ne 2,3 48ц ЕС 17,7 (р 0,95) W 8,5% (р - 0,68)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технике бактериологического анализа. Целью изобретег: НИН является повьшение точности и достоверности определения за счет стабилизации условий роста колоний. Для этого плотные питательные среды, на которых нанесены суспензии микроорганизмов, заземляют, что обеспечивает снятие возниканяцего при перераспределении влаги между пробой и средой электрического заряда и уравнивание условий образования колоний одиночными клетками. Для осуществления заземления плотных питательных сред, разлитых-в стеклянные чашки Петри, предназначено приспособление состоящее из электропроводной крьш- ки со штырем, контактирующим с питательной средой, и заземленного металлического поддона, через которые осу- . ществляется отток возникающего заряда. 4 табл. ю (Л

-4

-5

18

5

23

10

1681

25

324

25

529

ТаблицаА

-12

5

-10

-2

24

12

144

25

100

4

576

144

n

1A.58389

Продолжение табл.4

Известный способ

- П .--17-29 21 13 1

289 841 441 169

г 4424

N и 221.-51

/5SK

UJNn

22,2

iNj 2,3-48к 51,0

E 23,0% (P 0,95) , WK 11,0% (p 0,68)

12

Предлагаемый способ

5 -3

-5 -16

25 9

25 256

NO 250f27

/iSj

.SlNLb,,,6 f9-10

ANc 2,3-4Se 26,7 / 10,7% (p 0,95) We 5,1% (p 0,68)