.1.
Изобретение относится к микробиолсг- гии, биотехнологии и микробиологической промышленности и представляет собой средство для предотвращения фаголизиса культур Escherichia coli,
Целью изобретения является повышение устойчивости культур E.coli к различным бактериофагам, в том числе к бактериофагам, обладающим антире- стрикционным механизмом. Bgtil фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда, обеспечивающий повышенный уровень экспрессии генов rex АВ, при трансформации клеток рекомбинантными ппазмидами, содержацими этот фрагмент, обеспечивает устойчивость клеток к фаговой инфекции.
Наличие активных генов rex АВ фага лямбда в составе этого фрагмента
приводит к ограничению роста некоторых мутантных фагов Т4(5), Т5(6), Т7(7) , (J 80(8) в лизогенных клетках, в то время как дикие формы перечисленных фагов растут на лизогенных культурах без ограничения. Повышенная активность генов rex АВ фага лямбда, введенных в клетки E.coli путем трансформации рекомбинантными плазмидами, содержащими область иммунитета фага лямбда и обеспечивающими повышенный уровень синтеза продуктов генов rex АВ, по сравнению с лизоген- ными клетками, ограничивает рост в этих клетках диких форм бактериофагов Т4, Т5, Т7 и некоторых других. Повышенный уровень синтеза продуктов генов rex осуществляется в клетках Е.coli трансформированных рекомбим(
Од 00 «Ч
сл
со
нантными плазмидами, содержащими область иммунитета фага лямбда.с интак- тными генами rex АВ и дефектными ге нами репрессоров с1 (термочувствительная мутация ts857) и его (деле- ция, Л t или амбермутация, агаб). Белки-продукты генов сГ и подавляют экспрессию генов rex АВ, поэтому плазмиды с интактными генами репрессоров с1 и его не обеспечивают культурам E.coli достаточной устойчивости к бактериофагам,
BgiElI фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда, обеспечивающий при введении в клетку в составе рекомби- нантных ДНК устойчивость клеток к фаговой инфекции, состоит из: 2392 пары оснований; ограничен Bgfll сайтами рестрикции с координатами 35711 и 38103 пар оснований на ДНК фага лямбда; и содержит интактные гены rex ABj cl ген с термочувствительной мутацией 857, определяемой заменами С вместо Т в позиции 37589 (ind) и 37742 (с1 857), и часть гена его с позиции 38041 по -38103 пар оснований ДНК фага лямбда, Рг и Рт- промоторы фага лямбдаj 3 сайта Hlndlll.B позициях 36895, 37459, 37742 пар оснований.
Этот фрагмент может быть введен в ранее сконструированные рекомби нантные ДНК (напримерг плазмиды) с
Эффективность использования BglH фрагмента ДНК области иммунитета фага лямбда в составе рекомбинантных плаз- мид для повышения устойчивости куль- тур E.coli к различным бактериофагам показана в примерах 1-7.
Пример 1. Клетки E.coli В834 выращивают в 10 мл мясопептон- JQ ного бульона (МПБ) до плотности 4 к 10 кл./мл, осаждают центрифугированием 10 мин при О С (К-23, 6000 об/мин) промывают дважды 20 мл холодного раствора, содержащего; 15 трис-HCl, рН 7,7 - 0,01М, CaClg - 0,1М, ресуспендируют в 10 мл зтого раствора и выдерживают 20 мин в ледяной бане, ресуспендируют в 1 мл раствора. К 0,3 мл суспензии клеток добавляют 20 мкл раствора ДНК плазмиды pILRV8 с концентрацией 50 мкг/мп, ин- кубируют 50 мин при О С, 5 мин при 42 С., добавляют два объема среды LB, выдерживают 30 мин при 37°С и 25 высевают на агар, содержащий
30 мкг/мп хлорамфеникола. Выросшие клоны отбирают и определяют их устойчивость к бактериофагам.
Бактериофаг Т5 , выращенный на 30 культуре E.coli В834, высевают на газон культуры E.coli Б834, трансформированной плазмидой pILRVB. К 2 МП мягкого агара, приготовленного на среде LB с добавкой 10 мм СаСИ,
20
целью повышения устойчивости культуры - добавляют при 37 С 1 «10 свежих
г. . хч П
клеток в 0,2 мл среДы и по 10 частиц фага. Т5 на первые две чашки, по 50 на вторые две чашки и по третьи две чайки. Для контроля фаг Т5 высевают аналогично на чашки с газо- ном культуры E.coli В834 без плазмиды. Чашки инкубируют при 37 С 16 ч и определяют эффективность высева фага в опытных чашках и контрольных. На газоне в опытных чашках не видно негативных колоний фага Т5. Трансформированные клетки устойчивы к фагу 15. Проведенный анализ позволяет за- .ключить, что культура E.coli В834/
Плазмида pIL202 им.еет очень низкую QQ /pILRV8 устойчива ко всем используемым в данной работе бактериофагам, в том числе и к Д|зтт434 и к ТЗ и частично устойчива к фагу Т7 (менее 50% мелких колоний с диаметром около 1 мм). Ограничение фагов ТЗ и i 434 определяется наличием в плазмиде генов системы, рестрикции-модификации E.CORV и присутствием сайтов, узнаваемых этой эндонуклеазой, на ДНК этих
к фаговой инфекции.
Плазмиды, использованные в примерах,приведены в табл.1..
. Плазмиды pIL 202, р:а209, pcl857 содержат фрагменты области иммунитета 40 фага лямбда с пониженной активностью генов rex АВ и служат контролем для выявления генов фага лямбда, существенных для ограничения роста различных бактериофагов-в клетках E.coli. 45
Плазмида рс1857 не несет rex АВ- активности из-за делеции в генах rex АВ.
активность генов rex АВ из-за наличия интактных генов репрессоров с1 и его.
Плазмида pIL209 имеет низкую активность генов irex Ш из-за интакт- ного гена-респрессора его.
55
Остальные плазмиды имеют высокую активность 1 енов rex АВ.
р
463759
Эффективность использования BglH фрагмента ДНК области иммунитета фага лямбда в составе рекомбинантных плаз- мид для повышения устойчивости куль- тур E.coli к различным бактериофагам показана в примерах 1-7.
Пример 1. Клетки E.coli В834 выращивают в 10 мл мясопептон- JQ ного бульона (МПБ) до плотности 4 к 10 кл./мл, осаждают центрифугированием 10 мин при О С (К-23, 6000 об/мин) промывают дважды 20 мл холодного раствора, содержащего; 15 трис-HCl, рН 7,7 - 0,01М, CaClg - 0,1М, ресуспендируют в 10 мл зтого раствора и выдерживают 20 мин в ледяной бане, ресуспендируют в 1 мл раствора. К 0,3 мл суспензии клеток добавляют 20 мкл раствора ДНК плазмиды pILRV8 с концентрацией 50 мкг/мп, ин- кубируют 50 мин при О С, 5 мин при 42 С., добавляют два объема среды LB, выдерживают 30 мин при 37°С и 25 высевают на агар, содержащий
30 мкг/мп хлорамфеникола. Выросшие клоны отбирают и определяют их устойчивость к бактериофагам.
Бактериофаг Т5 , выращенный на 30 культуре E.coli В834, высевают на газон культуры E.coli Б834, трансформированной плазмидой pILRVB. К 2 МП мягкого агара, приготовленного на среде LB с добавкой 10 мм СаСИ,
20
бактериофагов. Фаг ТЗ ограничивается активностью генов rex АВ фага лямбда и системой рестрикции E.CORV, фаг Т7, который не имеет на своей ДНК сайтов E.CORV, только активность генов rex АВ, а фаг inim434 ограничи- вается только активностью гена, кодир гадего эндонуклеазу ре.стрикции E.CORV.
Зависимость устойчивости клеток E,coli B834/pILRV к бактериофагам от температуры культивирования осуществляют аналогично примеру 1, только чашки с высеянным фагом Т5 инкубирую при 26, 32, 38°С.
Показано, что при на агаризо ванной среде падение титра фага Т5 составляет около 90%, при 32°С падение титра достигает 99,91, при культура полностью устойчива к фагу Т5,
Определение устойчивости клеток E.coli B834/pILRV8 к бактериофагам при культивировании в жидкой среде.
К культуре клеток E.coli В834, трансформированных плазмидой pILRVB с плотностью 5«10 кп./мл в МПБ, добавляют фаг Т5 с множественностью. 0,3 и инкубируют при 37°С в условиях интенсивной аэрации 5 ч. За это время культура .выходит в стационарную фазу, лизиса культуры не наблюдают, так как клетки устойчивы к бактериофагу Т5.
Аналогично проводят определение устойчивости клеток E.coli/pILRV8. к фагу Т, ТЗ, Т7,080, P22,Ai434.
В случае фагов Т4, ТЗ, Z 80, Р22, Ai434 лизиса не наблюдают, так как клетки устойчивы к перечисленным бактериофагам и частично устойчивы к фагу Т7.
Определение урржая фага Т5.
Клетки E.coli B834/pILRV8 выращиваю в 10 МП МПБ до плотности 3-10 кл./мл осаждают центрифугированием (6000,. 10 мин) и ресуспендируют в V мп МПБ. В суспензию клеток добавляют фаг 15 с множественностью 0,5-0,8 и прово- дят адсорбцию фага 10 мин при 10 С. В этик условиях на клетках адсорбиру ют свыше 90% всего фага (в среднем 95%). Затем быстро делают разведения клеток -в. 10 раз в пробирках с холод- ным МПБ (10° С) так, чтобы в последней пробирке было кл/мп. Из этой пробирки отбирают аликвоты по 0,1 мп для титрования фага (титр 1) на гаг
5
0
0
5 5
5
зоне E.coli В834 при 37°С, затем содержимое пробирки делят пополам, нагревают на водяной бане одну пробу до 30°С, вторую до 37°С и инкубируют пробы при указанной температуре и усиленной аэрации 1,5 ч. Затем отбирают аликвоты по 0,1 мп и проб для второго титрования (титр 2).
.Титр 1 равен сумме инфицированных клеток, дающих фаговое потомство и . неадсорбированных инфекционных фаговых частиц. Титр 2 соответствует урожаю из инфицированных клеток. Отношение титра 2 к титру 1 приближенно характеризует выход фага на одну клетку.
Результаты одного из трех независимых опь:тов представлены в табл.2, в которой приведены также данные, полученные при анализе урожая фагов Т4 и Т7, а также при анализе урожая фагов Т5, Т4 и Т7, выросших на культуре E.coli В834 без плазмиды и с плазмидой pIL203, которая содержит область иммунитета фага лямбда с ин- тактными генами rex АВ и мутантными генами респрессоров , и сгоагаб.
Из табл.2 следует, что в клетках E.coli В834, трансформированных плаз- мидами с повышенной активностью генов rex,выход фагового потомства значительно ниже, чем в бесплазмидных клетках.
При повышении температуры культивирования с 30 до 37 С выход фага из клеток E.coli В834, трансформированных плазмидами pIL203 и pILRV8, значительно снижается.
При инфицировании клеток E.coli В834,трансформированных плазмидой. pILRV8, фагами Т4 или Т5 при 37°С, инфицированные клетки не дают фаго-. вого потомства, т.е. инфекция в этих условиях протекает абортивно.
Плазмида pILRV8 сильнее подавляет рост фагов, по сравнению с pIL203, что возможно объясняется с слабой супрессией мутации атпб гена его в штамме E.coli В834.
Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, используя вместо клеток E.coli В834 клетки E.coli С600.
Проведенный анализ позволяет заключить, что клетки E.coli С600/ /pILRV8 устойчивы к бактериофагам Т4, Т5,ТЗ,080, Р22 Aimm434. К фагу Т7 наблюдают частичную устойчивость
при выращивании культур на агаризо- iванной и жидкой средах. Урожай бакте риофагов Т5, ТА, Т7 падает соответ- ;ственно в 100, 100 и Ю раз.
Пример 3. Осуществляют аналогично примеру 1, используя вместо клеток E.coli В834 клетки E.coli С. Проведенный анализ позволяет за ключить, что культура E.coli С/ ;/pILRVS устойчива ко всем использу- |емым бактериофагам, кроме фага Т7 пр jкультивировании как в жидкой.среде, так и на агаризованной среде, К фагу Т7 наблюдают частичную устойчивость. Эффективность защиты от фаголизиса зависит от температуры. Оптимальной температурой для осуществления спосо |ба является 37-38 С. Урожай бактерио iфагов при росте на культуре E.coli jC/pILRV8 резко понижен по сравнению I с урожаем на бесплазмидном штамме, I Пример 4. Осуществляют анал jгично примеру 1, .используя вместо |щ1азмиды pILRVB плазмиду pFRD35. |: Трансформацию клеток E.coli В834 ; гшазмидой pFRD35. проводят как опи- Iсано в примере 1. Селективная среда {содержит 20 мкг/мп ампициллина. Пров {данный анализ показал, что клетки JE.coli B834/pFRD 35 достаточно устой Чивы при к бактериофагам Т7 и |ТЗ при росте как в жидкой так и на I твердой среде.
I Пример 5. Осуществляют ана- логично примеру 4, используя вместо ;клеток E.coli В834 клетки E.coli IC600. Проведенный анализ позволяет Iзаключить, что клетки E,,coli С600/ 1/pFRD 35 при 37 С устойчивы к бакте- риофагам Т5,080, Р22. К фагам Т4, |Т7, ТЗ, наблюдают частичную устой- 1чивость при выращивании культур на ;агаризованной и жидких средах.
Пример 6. Осуществляют аналогично примеру 4, используя вместо клеток E.coli В834 клетки E.coli С. Проведенный анализ позволяет заклю- чить, что культура E.coli C/pFRD 35 устойчива к фагам Т5, % 080, Р22, частично устойчива к фагам Т4, Т7, ТЗ, не устойчива к фагу /i i 434 при культивировании как в жидкой, так и на агаризованной среде. Эффективность защиты рт фаголизиса зависит от температуры, оптимальная температура для осуществления способа 3738°С.
Пример 7. Осуществляют аналогично примеру 1, используя вместо плазмиды pILRV8 плазмиду pIL203. Проведенный анализ показал, что эта
плазмида повышает устойчивость клеток к фаговой инфекции. Урожай фагов при росте на E.coli B834/pIL203 при 37°С в среднем приблизительно в 100 раз ниже урожая при росте на бесплазмидном щтамме в случае фагов Т4 и Т5 и в 10 раз ниже в случае фага. Т7.
В табл.3 приведены обобщенные результаты примеров 1-7.
Устойчивость культур E.coli, трансформированных рекомбинантными; плазмидами, содержащими Bglll фрагмент ДНК области иммунитета фага лям бда к бактериофагам, приведена также в табл.3.
Использованный нами Bglll фраг- мент ДНК области иммунитета фага лямбда с интактными генами гех АВ, термочувствительным геном с1 857, в
составе рекомбинантных плазмид обес- Лечивает устойчивость клеток E.coli к различным бактериофагам, в том числе к бактериофагам, обладающим антирестрикционным механизмом, по
сравнению с известным фрагментом.
Наличие в составе BgJtII фрагмента промотора Рг, регулируемого термочувствительным репрессором с1, делает
этот фрагмент ДНК удобным для конструирования векторов с регулируемой . экспрессией генов. Одновременно клетки E.coli, трансформированные этими векторами, делаются устойчивыми к
фаговой инфекции.
Формула изобретения
Применение Bglll фрагмента ДНК области иммунитета фага лямбда в качестве средства, обеспечивающего при введении в клетку в составе рекомбинантных ДНК устойчивость клеток Escherichia coli к фаг-олизису.
Таблица 1
Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и микро- биологической промышленности. Целью изобретения является повышение устойчивости культур Escherichia coli к различным бактериофагам,обладающим антирестрикционным механизмом, Bgtil - фрагмент ДНК области и иммунитета фага лямбда, обеспечивающий при введении в клетку в составе peri комбинантных ДНК устойчивость клеток к фагрвой инфекции, состоит из 2392 п.о., ограничен Bgfll сайтами рестрикции с координатами 35711 и ,38103 п.о. на ДНК фага лямбда; содержит интактные гены rex АВ; с1 ген с термочувствительной мутацией 857, определяемой .заменами с вместо Т в позиции 37589 (ind) 437742 (с1 857) и часть гена его с позиции 38041 по 38103 п.о. ДНК фага лямбда; Рг и Рт промоторы фага лямбда; 3 сайта Hindlll в позиции 36895, 37459, 37742 п.о. 3 табл. i (Л
Примечание. Плазмида pIL209 получена по схеме конструиро-,
вания плазмиды pIL203, но в качестве донора области иммунитета используют ДНК фага лямбда CI857.
Гены области иммунитета фага лямбда
Плазмиды,обеспечивающие устойчивость к фагам pIL 203 Ар гехАВ cits сгоатб
+ t +
f +
rexAB cits rexAB cits
его л его Л
Таблица 3
Устойчивость трансформированных культур
Т5 ТА IТ7 ТЗ 0 80 Р22 i
11434
вость к фагам
f +
t
t
+
+
+
+
+ +
| Benser SPNASUSA, 1955, v.41, p.344. |
