Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой реком- бинатную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез рестриктазы и метила- зы SsoII и штамм, содержащий эту ре- комбинантную ДНК - продуцент рестриктазы и метилазы SsoII.
Рестриктаза и метилаза SsoII узнает 5-членную вырожденную последовательность CCNGG, гидролизует ДНК с. образованием 5-членньтх липких концов, обеспечивая высокую эффективность при лигировании, и метилирует центральный цитозин в последовательности узнавания CCNGG, образуя модифицированное основание 5-метилцитозин.
Целью изобретения является увеличение синтеза рестриктазы и метилазы SsoII.
Поставленная цель достигается плазмидой d 24 и штаммом E.coli В834, содержащим эту плазмиду.
Плазмида d 24, кодирующая рестриктазу и метилазу SsoII. состоит из следующих элементов:
плазмидная ДНК вектора pUC19 размером 2,69 тпо;
плазмидная ДНК Р4 из S.sormei47-, кодирующая рестриктазу и метилазу SsoII, размер которой 4,4 тпо.
Штамм - продуцент рестриктазы и метилазы SsoII получен трансформацией клеток E.coli B834 плазмидой d24.
ел
00
со
ю
Ln
Содержание рестриктазы SsoII в сконструированном штамме равно 350000 ед./ биомассы клеток, метилазы 400000 ед.
Пример 1. Плазмидную ДНК из штамма Е. coli XS13, содержащего две плазмиды; Р4 и Р9, выделяют щелочным методом. Отделение ДНК плазмиды Р4 от высокомолекулярной ДНК Р9 проводят методом колоночной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе.
Полученный препарат плазмиды Р4 и препарат вектора pUC19 используют для конструирования плазмидыd24, которое проводят следующим образом.
0,5 мкг ДНК вектора pUC19 инкубируют с эндонуклеазой рестрикции SalGl (5 ед.) в буфере, А (100 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол). 5 мкг плазмиды Р4 инкубируют с рестрикта- зой SalGl (10 ед.) в буфере А.Реакции проводят при 37°С 1 ч. После инкубации пробы прогревают при 65°С 15 мин. Анализ полноты гидролиза про- водят с помощью электрофореза.
Соединение ДНК плазмиды и вектора проводят в буфере: 0,05 М трис-HCl, рН 7,4, 0,01 М 1 мМ дитиотрейтол, О,1 мМ АТФ с добавлением ДНК- лигазы Фага Т4 (1000 ед/мл) из расчета 0,5 мкл фермента на 5 мкг ДНК в течение 12 ч при 10°С.
. Полученную смесь соединенных фрагI ментов используют при трансформации клеток E.coli PS200. Трансформацию проводят следующим образом. 50 мкл суспензии клеток E.coli PS200 вносят в 20 мкл жидкой питательной среды LB и выращивают при 37°С до титра кл/мл. Клетки охлаждают во льду 10 мин и центрифугируют при 5000g в течение 10-15 мин при 4°С, затем тща- тельно сливают супернатант. осадок суспендируют в 0,5 мл 0,1 М СаС1. Клетки выдерживают во льду 10-12 ч, после чего используют для трансформации.
На 200 мкл суспендированных клеток E.coli PS200 берут менее 20 мкл соединенных фрагментов ДНК и инкуби - руют 40 мин во льду, затем в течение 90 с при 42°С и опять 2 мин во льду, добавляют 1,8 мл бульона LB и инкубируют 1 ч при 37°С. Затем 2 мл суспензии трансформированных клеток центрифугируют в течение Зев цент
5
о
0
5
рифуге Эппендорф при комнатной температуре и ресуспендируют в 100 мкл LB с 0,01 М MgS04. В пробу добавляют 100 мкл суспензии фага b 221 с титром 2, и инкубируют в течение 20 мин при 37°С. Затем клетки высевают на чашки с ампициллином в концентрации 50 мкг /мл .
Из клеток клонов, выросших на чашках с ампициллином, выделяют плаз- мидную ДНК, обозначенную d 24 и содержащую в своем составе вектор pUCl 9, несущий ген ВГа, определяющий устойчивость к ампициллину, и плазмидную ДНК Р4, несущую гены рестриктазы и метилазы SsoII. Выделенную плазмидную ДНК d 24 подвергают рестрикцион- ному анализу.
Пример 2. Определение присутствия рестриктазы и метилазы SsoII в штамме E.coli PS200, содержащем плазмиду d 24.
0,1 г биомассы E.coli PS200, содержащей плазмиду d 24, суспендируют в 170 мкл 0,01 мМ MJNCli, инкубируют при покачивании 2 ч при 4°С, центрифугируют при 10000 g 15 мин, затем 10 мкл супернатанта добавляют в пробу, содержащую 1 мкг бактериофага Л в 30 мкл буфера А. Пробу инкубируют 1 ч при 37°С, после чего анализируют электрофорезом в 1,2%- ном агарозном геле. Картина рестрикции в случае штамма-Е. coli PS200, несущего плазмиду d 24, характерна цля рестриктазы SsoII.
1 мкг плазмидной ДНК d 24, выделенной из штамма E.coli PS200, обрабатывают 10 ед. реетриктирующей эн- донуклеазы SSoII в буфере А в течение 2 ч при 37°С. Электрофорез показывает, что ДНК плазмидыd 24 при такой обработке не фрагментируется, в то время как плазмида pUC19 дает картину гидролиза, типичную для плазмиды pUC19, обработанной рестрикта- зой SsoII. Эти данные свидетельствуют о защите мест узнавания рестриктазы SsoII в d 24 метилированием.
Определение эффективности посева бактериофага Л b 221 на клетках штаммов , синтезирующих рестриктазу и метилазу SsoII, проводят следующим образом.,
Штамм E.coli PS200, несущий плазмиду d24, определяющую синтез рестриктазы и метилазы SsoII, снижает эффективность посева бактериофага
на 5 порядков по сравнению с эффективностью посева на нетрансформированном штамме E.coli PS200. После пассажа на клетках штамма E.coli PS200, трансформированных плазмидой d 24, фаг b 221 высевали на клетках штамма E.coli PS200, несущие плазмиду d 24 и штамма E.coli XS13, синтезирующих рестриктазу и метилазу SsoII. Снижения эффективности посева при этом не происходило, что свидетельствует о модификации ДНК фага ЛЬ 221, происходящей в клетках E.coli PS200, трансформированных плазмидой d24.
Пример 3. Плазмиду d 24 т трансформируют в штамме E.coli B834 по методу, описанному в примере 1, и
Активность рестриктазы SsoII определяют в серийных десятикратных разведениях супернатанта, 1 мкг ДНК фа- ,га А в 30 мкл буфера А (см.пример 1) инкубируют с 2 мкл каждого разведения. Уровень активности рестриктазы SsoII составляет 350000 ед.на 1 г биомассы.
Ю Активность метилаэы определяют в реакционной смеси с общим объемом 100 мкл, содержащей 1 мкг акцепторной ДНК, 0,5 МкКи 3H-S-аденозилме- тионина и 5 мкл каждого из десятикрат15 ных разведений сулернатанта. Инкубацию проводят в течение различных временных промежутков от J до 24 ч при 37°С. Пробы наносят на фильтры
GF/C, осаждают 5%-ной трихлоруксус- получают штамм - продуцент рестриктазы20 ной кислотой, отмывают 70%-ным эта- и метилазы SsoII.нолом, высушивают и просчитывают раШтамм Escherichiai. coli B834, не- диоактивность в толуоловом сцинтил- сущий плазмиду d 24 - продуцент реет- ляторе. За единицу ферментативной риктазы и метилазы SsoII, характери- активности принимают количество фер- зуется следующими признаками. 25 мента, обеспечивающего полную модиКультурально-морфологические. Клет- фикацию 1 мкг акцепторной ДНК за ки прямые, палочковидные, неподвижные, 24 ч.
грамотрицательные, лактозопозитивные. Уровень активности метилазы, опре- При рассеве на чашки с 1,3%-ным МПА деленный в штамме E.coli B834, несу- рост в виде отдельных колоний, иног- 30 щим плазмиду d24, соответствует
400000 ед. на 1 г биомассы.
В таблице приведены значения уров- ней синтеза рестриктазы и метилазы SsoII в штаммах E.coli, полученных 35 трансформацией плазмиды d 24.
Изобретение позволяет получить урода в R-форме с неровными краями. Хо- jpomo растет на плотных и жидких питательных средах (МПА, МПБ, LB-буль- он и LB-arap).
Физиолого-биохимические. Клетки растут в пределах 4-45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, лактозу, маннит с образованием кислоты, не разлагает сахарозу, сбраживает мальтозу, ксилозу, сорбит, дульцит, рамнозу, образует индол и сероводород, проявляет устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды d 24.
Пример 4. Культуру клеток E.coli B834, несущих ппазмидуd 2Ь, выращивают в 1 л среды LB с 50 мкг/мл ампициллина при 37°С до титра 4 10 кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 15 мин).
1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 50 мМ трис- НС1, рН 7,6; 0,1 М NaCl-, 7 мМ 2-мер- каптоэтанола, 100 мкг/мл лизоцима и выдерживают при 0°С 10 мин. Клетки разрушают ультразвуком. Экстракт получают центрифугированием при 2 С (48000) в течение 1 ч.
вень синтеза рестриктазы и метилазы SsoII в штамме, содержащем плазмиду d24, не менее 350000 и 400000 ед. на 4Q 1 г биомассы соответственно.
Формула изобретения
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК 45 d24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы SsoII мол.м. 4,5 ЭДД и размером 7,1 тпо, содержащая:
плазмидная ДНК вектора pUC19 размером 2,7 тпо;
до плазмидная ДНК Р4 с геном рестриктазы и метилазы SsoII размером 4,4тпо$
по одному участку расщепления эн- донуклеазами Bglll, Clal, EcoRV, SacII, PstI, SphI, Findlll, SaGI, Kpnl, Smal, 55 BamHI, Xbalj
по два участка узнавания эндонук- леазами - CfrlOl, Said;
четыре участка расщепления EcoRI;
bla ген, кодирующий /г -лактамазу;
Активность рестриктазы SsoII определяют в серийных десятикратных разведениях супернатанта, 1 мкг ДНК фа- ,га А в 30 мкл буфера А (см.пример 1) инкубируют с 2 мкл каждого разведения. Уровень активности рестриктазы SsoII составляет 350000 ед.на 1 г биомассы.
Активность метилаэы определяют в реакционной смеси с общим объемом 100 мкл, содержащей 1 мкг акцепторной ДНК, 0,5 МкКи 3H-S-аденозилме- тионина и 5 мкл каждого из десятикрат5 ных разведений сулернатанта. Инкубацию проводят в течение различных временных промежутков от J до 24 ч при 37°С. Пробы наносят на фильтры
вень синтеза рестриктазы и метилазы SsoII в штамме, содержащем плазмиду d24, не менее 350000 и 400000 ед. на 1 г биомассы соответственно.
Формула изобретения
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК d24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы SsoII мол.м. 4,5 ЭДД и размером 7,1 тпо, содержащая:
плазмидная ДНК вектора pUC19 размером 2,7 тпо;
плазмидная ДНК Р4 с геном рестриктазы и метилазы SsoII размером 4,4тпо$
по одному участку расщепления эн- донуклеазами Bglll, Clal, EcoRV, SacII, PstI, SphI, Findlll, SaGI, Kpnl, Smal, BamHI, Xbalj
по два участка узнавания эндонук- леазами - CfrlOl, Said;
четыре участка расщепления EcoRI;
bla ген, кодирующий /г -лактамазу;
фрагмент гена lac, соединенный с синтетическим полилинкером, расположенный по обе стороны клонированной ДНК плазмиды РА;
t гены рестриктазы и метилазы SsoII, расположенные на клонированной ДНК
плазмиды Р4, фланкированной сайтами SalGl, детерминирующие синтез рестриктазы и метилаэы SsoII.
2. Штамм бактерий Fscherichia coll ГЙСК-178 - продуцент рестриктазы и метилазы SsoII.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез рестриктазы и метилазы SSOII и штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК - продуцент рестриктазы и метилазы SSOII. Цель изобретения - увеличение уровня синтеза рестриктазы и метилазы SSII. Изобретение позволяет получить штамм с продукцией рестриктазы и метилазы SSOII - 350000 и 400000 ед. на 1 г сырой биомассы соответственно. 1 табл.
| Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1987 | |||
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
