Рекомбинантная плазмидная ДНК рУК11, кодирующая рестриктазу и метилазу Е coRII, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент рестриктазы и метилазы Е coRII Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 

I .

Изобретение относится к биотехно-. логин, в частности к генетической инженерии, и представляет собой pejcoM- бинантную плазмидную ДНК, обуславлит вающую синтез рестриктазы и метилазы Есо RII, спрсрб конструирования данной рекомбинатной плазмидной ДНК и . штамм, содержащий эту рекомбинантную плазмиду - продуцент рестриктазы и

метилазы Есо RII...

1 . ,

Рестрикциониая эНдонуклеаза (рест- риктаза) Есо RII и ДНК-метиптрансфе-. раза (метилаза) Есо RII широко используются в научно-исследовательской практике (генетическая инженерия, cтpyктypнo-JlгyнкциoнaльньIй анализ ДНК

изучение белок-нукЛеинового взаимодействия и др.).

Цель изобретения является увеличение содержания рестриктазы и метилазы Есо RII в клетках бактерий.

1. Получена рекомбинантная плазми- да pVKll, обеспечивающая повышенный синтез рестриктазы и метилазы Есо RI1. 2. Разработан способ конструирования рекомбинантной плазмиды pVKI1, в которой гены рестриктазы и метнла- зЫ Есо RII находятся под левым промотором фага лямбда (Р) то обеспечивает эффективную экспрессию генов рестриктазы и метилазы Есо RII.

3. Получен штамм Escherichig coli ВКМ CR-288D, имеющий более высокий.

4ib СЛ

О9 00 05

;, .1453896

уровень синтеза рестриктаэы и мети- .лазы Есо RII по сравнению с нзвестны- штаммами про дуцентами ферментов Есо RII.,

, А, Плазмида pVKII, крднрующая ре- . стриктазу и метипазу Есо RII состоит из ДИК pLC 2833 (размер которого 2,8 ТПО), содержащего левый проКлетки,прямые, палочковидной фор мы (1,2-1,б)х(2,0-6,0) мкм, подвижные, с перитрихиальньми жгутиками, грамотрицатеяьные, неспороносные.

Культуральные признаки.

Кпеткн хорошо,растут на простых питательных средах..,

При росте на мясо-пептоином ага15

20

25

30

Мотор фага лямбда (Рь); Pet I - фраг- ю Ре, питательном агаре Дифкр коло- мента ДНК плазмиды pVK 33, содержащего гены рестриктазы н метилазы Есо RII Хрзэ| 1ер котррохп 5 ТПО), и имеет . уникальные участки рестрикции для зн- . донуклеаз Есо RI, Sal I, Xba I, расположенные на расстоянии 0,1 ТПО от промотора Р/,; селективные маркеры Ар 1шп J хозяин Escherichia coli.

Б. Для достижения,цели используют способ конструирования плаэмидной ШК кодирующей рестриктазу и ,мети- лазу Есо RII, заключающийся в том, что плазмидаую ДНК pLG 2833 и ДНК pVK ЗЭ подвергают совместному гидролизу эндонуклеазой рест рикции Pst I. Образовавшиеся фрагменты соединяют ДНК лигазой, затем по,лученной смесью - |рекомбинантных молекул трансформируют клетки Е. coli СбОО (Л). ТрансФорман ть высевают на среду с -ампи циллином и выросшие колонии проверяют на способность рестрикзгировать и модифицировать фаг лямбда in vivo. Из отобранных трансформантов вьщеляют плаз- мидную ДНК, обозначенную как pVK М.

В. -Для достижения цели получен также штамм бактерий Echerichia coli ВКМ CR-288D - продуцент рестриктазы И метипазы Eeo.EII. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроор- анизмов при ИБФМ АН СССР под номером В1да CR-288D,

Штагф - продуцент рестриктазы-и йетИлазы Е-СО RII получен трансформацией клеток Е. coli В834/рС1857 ппазмидной ДНК pVK 11. Выбор штамма Е, coli В834(). обусловлен тем, , )что штамм не содержит инте1х11ерирую- (цих с ферментами Есо RII примесей и |со;5 Р плазмид;у с геном термочувствительного репрессора сI фага ляйбда. Содержание рестриктазы и метилазы Есо RII в сконструированном штамме равно 500000 ед. калздЬго фермента на 1 г сырой биомассы клеток.

Штамм Escherlchia coli ВКМ CR - 288D характеризуется следующими признакамиi

1&)рфологические признаки.

НИИ гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, с ровными крайми. При росте в жидких средах - мясо-пеп тонном бульоне, питательном бульоне Дифко образует ровную интенсивную муть. .I

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах А - при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности d-глюкозу, d-фруктозу, арабинозу, лактозу тре- галозу. Не усваивает ацетат, аданит, галактозу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и в органической в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют. Уреазная активг ность не обнаруживается.

Устойнивость к антибиотикам.

Проявляют устойчивость к ампицил- лину, обусловпенную наличием плазми,- ды pVK П, а также к канамицину, обусловленную наличием плазмиды рС 1857.

1Йтамм Е. coli ВКМ CR-288D проявляет иммунитет к фагу лямбда. Продуктивность штамма составляет 500000 ед. каждого фермента на 1 г сырой биомассы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример..

Клетки бактерий Е. coli, содержащие плазмидную ДНК, выращивают в бульоне Дифко до титра 2x10 кл/мл Клетки -собирают центрифугированием и из них вьщеляют ДНК. Полученные препараты ДНК плазмиды pLC 2833 и плаз- миды pVK 33 используют для конструирования плазмиды pVK 11. 2 мкг ДНК плазмиды pLC 2833 инкубируют с эндог нуклеазой рестрикции Pst I (0,5 е). Реакцию проводят при 1 ч. 3 мкг ДНК плазмвды pVK 33 расщепляю,т эндонуклеазой рестрикции Pst I (5 е).

40

45

50

55

Клетки,прямые, палочковидной фор мы (1,2-1,б)х(2,0-6,0) мкм, подвижные, с перитрихиальньми жгутиками, грамотрицатеяьные, неспороносные.

Культуральные признаки.

Кпеткн хорошо,растут на простых питательных средах..,

При росте на мясо-пептоином агаРе, питательном агаре Дифкр коло-

5

0

5

0

Ре, питательном агаре Дифкр коло-

НИИ гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, с ровными крайми. При росте в жидких средах - мясо-пеп- тонном бульоне, питательном бульоне Дифко образует ровную интенсивную муть. .I

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах А - при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности d-глюкозу, d-фруктозу, арабинозу, лактозу тре- галозу. Не усваивает ацетат, аданит, галактозу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и в органической в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. . Индол не образуют. Уреазная активг ность не обнаруживается.

Устойнивость к антибиотикам.

Проявляют устойчивость к ампицил- лину, обусловпенную наличием плазми,- ды pVK П, а также к канамицину, обусловленную наличием плазмиды рС 1857.

1Йтамм Е. coli ВКМ CR-288D проявляет иммунитет к фагу лямбда. Продуктивность штамма составляет 500000 ед. каждого фермента на 1 г . сырой биомассы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример..

Клетки бактерий Е. coli, содержащие плазмидную ДНК, выращивают в бульоне Дифко до титра 2x10 кл/мл. Клетки -собирают центрифугированием и из них вьщеляют ДНК. Полученные препараты ДНК плазмиды pLC 2833 и плаз- миды pVK 33 используют для конструирования плазмиды pVK 11. 2 мкг ДНК плазмиды pLC 2833 инкубируют с эндог нуклеазой рестрикции Pst I (0,5 е). Реакцию проводят при 1 ч. 3 мкг ДНК плазмвды pVK 33 расщепляю,т эндонуклеазой рестрикции Pst I (5 е).

0

5

0

5

514538966

Пробы после инкубации Прогревают при ную как pVK Пи содержащу о в своем

15

65 С 10 мии. Продукты гидролиза анализируют электрофорезом в l - HOM ага- роэиом геле.

Соединение фрагментов ДНК плазмид проводят в буфере для рестрикции с добавлением АТФ и дитиотраитола до конечной концеитрацииМ и 5 мМ соответственно и дак-лигйзы (10 е).

Реакцию проводят 10-12 ч при IA - , Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток Е, coli С600 (Л). Клетки Е. coli С600 () вносят в 10 мл питательного бульона и выращивают до титра 1х х10 клТмл. Клетки собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин, ), суспендируют в 10 мл 0,2 М р-ра СаС и вьздерживают 1 ч при 0°С. Клетки повторно собирают центриЛугированием, ресуспендируют в 0,3 мл 0,08 М СаС1г () и используют для трансформации.

Смесь лигированньк фрагментов ДНК инкубируют с кле.тками Е. coli В83А/рС1857, обработанными раствором CaCl, 1 ч при и 10 мин при комнатной температуре (18-20 С). После .десятикратного разбавления суспензии питательным бульоном трансфорКирован- 30 ныв клетки подращивают 2 ч при 28°С и высевают на агаризованную среду с ампициллином (50 мкг/мл). Клетки,

составе три фрагмента, кото.рые обра- ауются при гидролизе гшазмидной ДНК эиДонуклеазой рестрикции Pet I.

Выделенную ДНК pVK 11 трансформируют в штамм Е. coli В83А/рС1857« Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (50 ) -и 10 канамицин (25 мкг/мл). Плазмида

рС1857 несет термочувствительную мутацию в гене репрессора CI, Таким об разом можно увеличить транскрипцию, за счет температурных условий культи |вирования.

Клетки Е. coli В834/рС1857/р ГКП выращивают при 28 С до плотности 2- 4-10 кл/мл, резко повьппают темпера туру до и проводят инкубацию в течение 4 ч. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в буфере 0,01 М калий-фосфат (рН 7,0), 1 мК ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанал; 0,4 мМ Had, разрушают ультразвуком. После разрушения центрифугируют (100000 Е. 1 ч, ). Бесклеточньй зкстракт используют для определения ферментативной активности. Акти вност метилазы определяют в реакционтгой смеси общим объемам 150 мкл, содержащей 40 мМ калий-фосфат (рН 7,8), 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мкг ДИК К. coli В834, 4 мМ S-аде- нозила (метил- Н) метионина и 50 мкл

20

25

Клетки Е. coli В834/рС1857/р ГКП выращивают при 28 С до плотности 2- 4-10 кл/мл, резко повьппают температуру до и проводят инкубацию в течение 4 ч. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в буфере 0,01 М калий-фосфат (рН 7,0), 1 мК ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанал; 0,4 мМ Had, разрушают ультразвуком. После разрушения центрифугируют (100000 Е. 1 ч, ). Бесклеточньй зкстракт используют для определения ферментативной активности. Акти вность метилазы определяют в реакционтгой смеси общим объемам 150 мкл, содержащей 40 мМ калий-фосфат (рН 7,8), 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мкг ДИК К. coli В834, 4 мМ S-аде- нозила (метил- Н) метионина и 50 мкл

выросшие на среде с йнтибиотиками,

проверяют на рестрикцию и модификацию gфермента в различных разведениях.

фага Л системой Eco.RII.Реакцию проводят 1 ч при 37°С,,добавСтепень рестрикции фага Д vir, вы-ляют равный объем 0,75 N натриевой

ращенного на штамме Е. coli СбОО, оп-щелочи, инкубируют 30 мин при 60 С.

щелочи.

ределяют сравнением титра фага при посеве его на штаммы Е. coli СбОО (А) и Е. coli C600/pVK33 и клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды. При высеве фага на клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, несущие гены рестриктазы и метилазы Есо RII, они ограничивают сост фага по сравнению со штаммом , СбОО (А ) на два порядка, как и на штамме C600/pVK33. Фа- |ги, выросшие на зтих клонах, содержащих рекомбинантные ДНК, высевают на штам- мы СбОО () и СбОО/рУКЗЗ. Фаги, выросшие на клонах, содержащих рекомби- нантные плазмиды, aecymjie гены Есо RII, дают одинаковый титр как на штамме СбОО (Д), так и на штамме C600/PVK33.

Из клеток клонов, обеспечивающих рестрикцию и модификацию фага Лvir, вьщеляют плазмидную ДНК, обозначен

5

0

составе три фрагмента, кото.рые обра- ауются при гидролизе гшазмидной ДНК эиДонуклеазой рестрикции Pet I.

Выделенную ДНК pVK 11 трансформируют в штамм Е. coli В83А/рС1857« Трансформанты отбирают на среде, со- держащей ампициллин (50 ) -и канамицин (25 мкг/мл). Плазмида

рС1857 несет термочувствительную мутацию в гене репрессора CI, Таким образом можно увеличить транскрипцию, за счет температурных условий культи- |вирования.

Клетки Е. coli В834/рС1857/р ГКП выращивают при 28 С до плотности 2- 4-10 кл/мл, резко повьппают температуру до и проводят инкубацию в течение 4 ч. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в буфере 0,01 М калий-фосфат (рН 7,0), 1 мК ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанал; 0,4 мМ Had, разрушают ультразвуком. После разрушения центрифугируют (100000 Е. 1 ч, ). Бесклеточньй зкстракт используют для определения ферментативной активности. Акти вность метилазы определяют в реакционтгой смеси общим объемам 150 мкл, содержащей 40 мМ калий-фосфат (рН 7,8), 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мкг ДИК К. coli В834, 4 мМ S-аде- нозила (метил- Н) метионина и 50 мкл

0

5

щелочи, инкубируют 30 мин при 60 С.

щелочи.

Затем к пробам добавляют 2 мл воды и 2 мл 10% трихлоруксусной кислоты. Осажденную ДНК наносят на стеклово- локнистые фильтры, прбмьшают 0,01 М НС1 и спиртом. После просушки фильтров считают радиаактивность. За еди-; ницу активности метилазы Есо RII . - принимают то количество фермента, которое в указанных условиях включает 1 пкМ CHj - групп в ДНК за 1 ч при . Активность рестриктазы Есо RII определяют в смеси 20 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 10 мМ MgCli, 50 мМ NaCl, 1 мкг ДНК плазмеды pBR 322 (из Е. coli B834/pBR322) и различные развёде- НИЛ фермента. Реакцию ведут 15 мин . при 37°С. Продукты гидролиза ДНК анализируют в 1% агаровом геле. За еди- ницу активности принимают то количество фермента рестриктазы Есо RII, которое необхддимо для полного рас

, 7 U53896. , 8

цепления. I мкг ДНК pBR 322 за 15 мни ог1 репликации плазмиды pBR 3221 се ,-- .. А «« .1- .. - l

при . . Изобретение, no9Bcuuet получить шташ - продуцент pectpuRTadbi и ме- , типазы Есо. RII с уровнем синтеаа в этих е{ментов не менее 500000 ед. каждого на 1 г сырой биомассы клетбк,) что в 10 раз выпю уровни синтеза этих ферментов в сравйеннн с лучшими из fo .известных штаммов t

Лектичные Маркеры; itran ; хозяин - Escherichia eelI.

2, Способ конструирования плазмид- ной ДНК pVK 11, кодирующей ре стрикта- зу и метилазу Есо RII, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pLC 2833 и/ ДНК плазмиды pVK 33 подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции Pst 1, - полученйые Фрагменты смешивают и со- -. единяют ДНК-лигазой, затем смесью ре- комбинантных мблекул трансформируют

Ф о р мул а N и 3 о. б р е т ё ни я

1,Ч екомбинантная плазмидная ДНК (ук II, кодирующая рестриктазу и ме- тилазу Есо RII, размером 7,8 т,п.о, содержаща.я ДНК вектора pLC 2833, размером 2,8 т.п.о, с левым промотором

.фаги лямбда (Р) Pst Г - фрагмент ДНК плазмиды pVK 33 с геном рестрик- taзы и метнлазы Есо RII размером 5,0 т,п.о.{уникальные участки рестрикции для эндрнуклеаз Есо RI, ХЬа I, Sal 1, расп6Ь: женные на рдс

.стоянии О,.4 т,п.о от промотчзра Гц;

ог1 репликации плазмиды pBR 3221 се 1- .. - l

Лектичные Маркеры; itran ; хозяин - Escherichia eelI.

2, Способ конструирования плазмид- ной ДНК pVK 11, кодирующей ре стрикта- зу и метилазу Есо RII, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pLC 2833 и/ ДНК плазмиды pVK 33 подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции Pst 1, полученйые Фрагменты смешивают и со- единяют ДНК-лигазой, затем смесью ре- комбинантных мблекул трансформируют

1 летки Е. coll СбОО (Л), трансформанты высевают На среду с амйицшши- ном и выросшие клоны проверяют на способность рестриктировать и модифицировать фаг лямбда из Клонов, которые рестриктировали и модифицировали фаг лямбда со специфичностью системы Есо RII, вьщеляют плазмидную ДНК pVK 11. ,

3i Штамм бактерий Escherichia со11 ВКМ CR-288D -- продуцент рестрикта- зы.и метилазы Есо Rli,

Изобретение относится к микробиологии, в частности к технологии ре- комбинантных ДНК, и позволяет получить рёстриктазу и метилазу Есо RII ферментов, используемых в научно-исследовательской практике. Целью изобретения является повыпение содержания рестриктазы и метипазы Есо RII в клетках бактерий, С этой целью ; сконструирована рекомбинантная ДНК pVK I, содержа1цая фрагмент ДНК с полными генами рестриктазы и метипазы Есо RII и левый промотор фага лямбда, обеспечивающий эффективную экспрессию генов Есо RII. pVKlI трансформирована в клетки Escherichia Есо RII не менее 50000 ед. каждого фермента на I г сырой биомассы клеток. 3 с.п. ф-лы. (Л