Способ хранения коллекционных культур микроорганизмов Советский патент 1989 года по МПК C12N1/04 

формировать желатиновые шарики с достаточным количеством клеток.

Для восстановления культуры из хранения петлей шарик вынимают из масла, помещают в пробирку с жидкой питательной средой (1 мл) в термостат при температуре +37 С до полного растворения желатина. Полученную таким образом суспензию клеток рассеивают по 0,1 МП на чашки с оптимальной для данного микроорганизма средой. После инкубирования в термостате при соответствующем режиме подсчитывают вьфосшие колонии, находят среднее число и делают пересчет на 1 мл желатиновой среды, где хранились шарики, срав1швают полученное число с исходным количеством клеток в этой среде перед закладкой культуры на хранение и оценивают эффективность хранения.

Хранению подвергают ксшлекцион- ные штаммы НИКТИ .БАВ: штаммы грам- отрицательных неспорообразующих бактерий Escherichia coli, Xanthomonas malvacea rum, штаммы дрожжей Saccharo-. tnyces cerevisiae, щтаммы спорообра- зующих грамположительных бактерий

14654544

каплям (0,05 мл) закапывают в пробирки с охлажденным по льду вазелиновым маслом (20 капель в 1 пробирку с 5 мл масла), где капли желатиновой суспензии застывают в виде

шариков, пробирку закрывают пробкой и хранят в морозильнике при -5 С.

Для Е.coli В. при исходном титре 10 клеток в желатиновых шариках 3,9 10 кл/мл титр через 3 года-1,4-10, через 4 года - 110, культура была жизнеспособна и через пять лет,что заметно превышает срок хранения 15 культуры по прототипу.

Основные морфологические, куль- турально-биохимические свойства культуры E.coli В, восстановленной из хранения в желатиновых шариках, 20 соответствовали основным исходным свойствам.

Состав желатиновой среды,мае.%: Желатин15

Глицерин20

25 1%-ная пептонная

водаОстальное

Приготовление желатиновой среды. 15 г желатина заливают 20 мл 1%-ной пептонной воды, ставят набу-

Bacillus globigii. Bacillus subtil is, 30 хать на 15 мин, затем желатин расBacillus amiloliquefaciens. Bacillus sphaericus, грамположительньш неспо- рообразуюш;ий штамм Staphylococcus aureus, грамвариабельные штаммы не- спорообразую1цих бактерий Arthrobac- ter luteus.

После восстановления из хранения штаммы проверяют на соответствие основным признакам (морфология клеток и колоний, чувствительность к антибиотикам, рост на средах с углеводами, образование сероводорода и индола, наличие амилазы, цистиназы,уре- азы, желатиназы) на способность к специфической продуки ии.

Пример 1. Готовят густую суспензию клеток штамма E.coli В. Для этого пятью мл 1%-ной пептонной воды делают смыв с 2-3 косяков суточной культуры E.coli В. 1 МП смыва смешивают с 3 мл растопленной и остуженной до 45 С желатиновой среды (состав приведен ниже), из части полученной суспензии готовят разведеплавляют при подогревании на водяной бане, добавляют 20 мл глицерина и доводят объем геля до 100 мл 1%-ной пептонной водой, рН 7,2-7,4.

п Разливают желатиновую среду по 3 мл в пробирки, трижды автоклавируют текучим паром и хранят в холодильнике.

Пример 2. Подготовку споро40 носной бактерии Bacillus globigii продуцента рестриктазы Bgl I, II для хранения в желатиновых шариках проводят .аналогично примеру 1, за исключением того, что концентрации

лк желатина и глицерина в среде сос тавляют 10 и 20 мас.% соответственно и температура хранения -10°С. Исходный титр культуры 5-10 кл./мл, через 3 года хранения - 5,6-10 ,

gg через 4 года хранения - .2,5-10 , через 5 лет хранения - 2,8«10 .

Основные культурально-биохимичес- кие, морфологические свойства и способность к специфической продукции

ния и высеивают по 0,1 мл на 2-3 чаш- gg культуры (рестриктаза Bgl I, II), ки питательного агара, для подсчету , восстановленной после хранения в же- количества жизнеспособных клеток в 1 мл смеси перед закладкой культуры на хранение. 2 мл смеси по

латиновых шариках, соответствовали исходным свойствам, эффективность сохранения жизнеспособности клеток

ариков, пробирку закрывают пробкой и хранят в морозильнике при -5 С.

Для Е.coli В. при исходном титре клеток в желатиновых шариках 3,9 10 кл/мл титр через 3 года-1,4-10, через 4 года - 110, культура была жизнеспособна и через пять лет,что заметно превышает срок хранения культуры по прототипу.

Основные морфологические, куль- турально-биохимические свойства культуры E.coli В, восстановленной из хранения в желатиновых шариках, соответствовали основным исходным свойствам.

Состав желатиновой среды,мае.%: Желатин15

Глицерин20

1%-ная пептонная

водаОстальное

Приготовление желатиновой среды. 15 г желатина заливают 20 мл 1%-ной пептонной воды, ставят набу-

0 хать на 15 мин, затем желатин расплавляют при подогревании на водяной бане, добавляют 20 мл глицерина и доводят объем геля до 100 мл 1%-ной пептонной водой, рН 7,2-7,4.

п Разливают желатиновую среду по 3 мл в пробирки, трижды автоклавируют текучим паром и хранят в холодильнике.

Пример 2. Подготовку споро40 носной бактерии Bacillus globigii продуцента рестриктазы Bgl I, II для хранения в желатиновых шариках проводят .аналогично примеру 1, за исключением того, что концентрации

лк желатина и глицерина в среде сос тавляют 10 и 20 мас.% соответственно и температура хранения -10°С. Исходный титр культуры 5-10 кл./мл, через 3 года хранения - 5,6-10 ,

gg через 4 года хранения - .2,5-10 , через 5 лет хранения - 2,8«10 .

Основные культурально-биохимичес- кие, морфологические свойства и способность к специфической продукции

gg культуры (рестриктаза Bgl I, II), , восстановленной после хранения в же-

культуры (рестриктаза Bgl I, II), восстановленной после хранения в же-

латиновых шариках, соответствовали исходным свойствам, эффективность сохранения жизнеспособности клеток

сравнима с результатами хранения по прототипу.

П р И м е р 3. Подготовку кил- лерного штамма дрожжей S. cerevi-

siae для хранения в желатиновых шариках проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что концентрации желатина и глицерина составляют 20 и 40 мас.% соответственно и тем- пература хранения -15°С. Для вьфащи вания штамма используют плотную и жидкую среду Сабуро. Исходный титр живых клеток дрожжей S.cerevisiae составлял 1,4-10 кл./мп после 2 ле хранения - 3,3 Ю , после 4-1,2-10 после 5 лет - 7,7-10з. Срок жизнеспособности клеток, хранящихся в же- ла:тиновых шариках, превышает по результатам хранения прототип.

Культурально-биохимические, морфологические свойства и признак кил- лерности типичны у всех проведенных клонов культуры, восстановленной после хранения в желатиновых шариках

Пример 4. Подготовку культуры S.aureus Cowan I продуцента белка А для хранения в желатиновых шариках проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что концентрации желатина и глицерина составляют 15 и 40 мас.% соответственно и температура хранения -15 С. Исходный титр культуры 2,2-10 кл./мл, через 3 года хранения 1,1 -10, культура жизнеспособна и через 4 года хранения, что превышает сроки хранения S.aureus под слоем минерального масла в столбиках полужидкого агара, Культурально-биохимические, морфологические свойства культуры S.aureus Cowan 1, восстановленной после хранения в желатиновых шариках, соответствовали основным исходным свойствам, способность к продукции белка А сохранялась..

Пример 5. Подготовку культуры Arthrobacter luteus продуцента рестриктазы А lu I для хранения в желатиновых шариках проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что концентрации желатина и глицерина составляют (10 и 4.0 мас.% соответственно и температура хранения -10 С. Исходный титр культуры 4,5 10 кл./мл, через 1 год хранения - 7,8-10, через 3 года - 1-10, через 4 года - 4,8-10, через 5 лет - 1,3-1 о , через 6 лет - 540. Морфо

g

i6 15 20

25

30

35

0

5

0

логия и основные биохимические свойства культуры, восстановленной после хранения в желатиновых шариках, без изменений, способность к специфической продукции (рестриктаза А lu I) сохраняется. Сохранность жизнеспособных клеток А. luteus в желатиновых шариках сравнима с результатами хранения по прототипу. , Результаты, представленные в примерах 1-5, сведены в табл. 1-4.

Из табп.1 видно, что при использовании жедатина в среде в концентрации менее 10% шарики сливаются, а при концентрации желатина в среде более 20% вязкость смеси слишком большая, среда трудно размешивается и раскапьшается (для работы непригодна) .

При использовании глицерина в желатиновой среде менее 20% возможно промерзание шариков, концентрация глицерина более 40% экономически невыгодна, так как не приводит к дальнейшему увеличению срока хранения микроорганизмов.

Как видно из табл. 2 и 3, предла- гаемьш способ позволяет давать количественную оценку эффективности хранения клеток при экономном расходе хранящейся культуры.

Предлагаемый способ позволяет сохранить жизнеспособность неспороносных бактерий и дрожжей до 4-5 лет срок хранения спорообразующих бактерий сравним с результатом по прототипу (5 лет, срок наблюдения).

При использовании запредельных значений температур хранения эффек- тивность хранения уменьшается (см. табл.4).

Преимущество предлагаемого способа заключается в удлинении срока хранения неспороносных бактерий и дрожжей под вазелиновым маслом с 1- 2 до 4-5 лет и возможности количественного учета жизнеспособности кле-, ток до оценки эффективности хранения.

Формула изобретения

Способ хранения коллекционных культур микроорганизмов путем выра- 1Щ1вания культуры на благоприятной для роста питательной среде, после- дукнцего ее хранения под минеральным маслом при пониженной температуре.

отличающийся тем, что, с цепью увеличения срока хранения культур, хранению подвергают суспензию кл-еток, смешанную с расплавленной желатиновой средой, содержащей глицерин и 1%-ную пептонную воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

1465454

Желатин10-20

Глицерин20-40

пептонная водаОстальное

полученную смесь закапывают в ох- лаяоденное мине эальное масло для формирования шариков и хранят их в масле при температуре от -5 до -15 С.

мирования шариков и хранят их в масле при температуре от -5 до -15 С.

Изобретение относится к микро- биологии, а именно к способам хранения коллекционных культур микроор- ганизмон. С целью увеличения срока 1 .Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам хранения коллекционных культур микроорганизмов. Целью изобретения является увеличение срока хранения культур. Способ осуществляют следующим образом. Суспензию клеток культуры, находящейся в стационарной фазе роста,хранения культур под вазелиновым маслом суспензию клеток культуры, выросшей на благоприятной питательной среде и находящейся в стационарной фазе роста, смешивают с расплавленной желатиновой средой, содержащей глицерин и 1%-ную пептонную воду,при следующем соотношении компонентов, мас.%: желатин 10-20, глицерин 20- 40, 1%-ная пептонная вода - остальное. Полученную смесь закапывают в охлалзденное вазелиновое масло для получения шариков и хранят их при температуре от -5 до -15 С. Суспензию клеток смешивают с расплавленной желатиновой средой, преимущественно в соотношении 1:3, что позволяет формировать желатиновые шарики с достаточным количеством клеток. Предложенный способ позволяет удлинить срок хранения неспороносных бактерий .и дрожжей с 1-2 до 4-5 лет и обеспечивает количественный учет жизнеспособных клеток культур, хранящихся в желатиновых шариках.4 табл. смешивают с расплавленной желатиновой средой (в соотношении 1:3),состоящей из желатина 10-20 мас.%, глицерина 20-40 и 1%-ной пептонной воды, полученную смесь по каплям

Формирование шариков в зависимости от концентрации желатина и глицерина в защитной среде

Примечание

+ шарики формируются, не замерзают, условия пригодны для использования при хранении, - шарики не формируются, при температуре ниже

-15 с замерзают, смесь для использования непригодна

Таблица 1

. 91.46545410

Сроки жизнеспособности культур микроорганизмов при хранении и по прототипу и предлагаемому способу

Примеча ние. + - штамм жизнеспособен, ± - слабая выживаемость

оггамма, - - штамм нежизнеспособен.

3 temiB«ocTb хмтжя untpoopremisMOB ирвдпагав свосовон

Таблица 2

П р и м е ч а н и е. При хранении на -20°С шарики смерзлись, культуры титровались после размораживания

Таблица