РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК ECO 1831KI, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКАЦИИ ECO 1831KI, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECO 1831KI Российский патент 1996 года по МПК C12N15/55 C12N9/16 C12N1/21 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генной инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез эндонуклеазы рестрикции Eco1831kI, и штамм бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-N/CCSGGN-3' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Eco1831kI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является ложным изошизомером известной рестриктазы CauII и может найти применение в генно-инженерных исследованиях.

В статье Bingham и Darbyshire описан продуцент рестриктазы CauII фотосинтезирующая бактерия Chloroflexus aurantiacus. Бесклеточный экстракт, полученный из 1 г биомассы, содержит 550000 ед. активности двух рестриктаз: CauI и CauII, что существенно затрудняет очистку рестриктазы CauII. Выход очищенного фермента CauII составляет 70000 ед/г биомассы. Кроме того, рестриктаза CauII расщепляет нуклеотидную последовательность 5'-NCC/SGGN-3' после второго 5'C, образуя 5'-выступающие однонуклеотидные липкие концы. Это затрудняет введение меченых нуклеотидов в сайты, образованные рестриктазой CauII. Для получения биомассы Chloroflexus aurantiacus необходимо использование специального оборудования, обеспечивающего облучение культуры при выращивании, что усложняет процесс культивирования.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение является получение штамма, продуцирующего рестриктазу со специфичностью 5'-N/CCSGGN-3' и расщепляющую эту последовательность перед первым 5'С, с высоким выходом, быстро растущего на обычных питательных средах.

Сущность предлагаемых изобретений состоит в том, что получена рекомбинантная плазмида pEC01831kI с генами системы рестрикции-модификации Eco1831kI, обуславливающая синтез рестриктазы Eco1831kI, и штамм бактерий, содержащий эту рекомбинантную ДНК продуцент рестриктазы Eco1831kI.

Полученная рекомбинантная плазмида pECO1831kI размером 8,1 т.п.н. кодирующая эндонуклеазу рестрикции Eco1831kI, является неконъюгативной, совместимой с мультикопийными плазмидами ColE1-типа, и состоит из следующих элементов: BglII-фрагмента ДНК природной плазмиды р1831 размером 5,4 т.п.н. содержащего гены рестрикции-модификации Eco1831kI, и BamHI-фрагмента ДНК векторной плазмиды pUC19 размером 2,7 т.п.н. Плазмида содержит три участка узнавания для R. EcoRI, расположенных на расстоянии 0,25 т.п.н. 1,2 т.п.н. и 6,65 т. п. н. два участка узнавания для рестриктазы StyI, расположенных на расстоянии 1,9 т.п.н. и 6,2 т.п.н. и по одному участку узнавания для рестриктаз: KpnI, SaII, HindIII, PstI, SmaI; bla-ген, ответственный за синтез бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину; eco1831kIR-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции Eco1831kI, обеспечивающий ограничение фага ⊘ 80 vir; eco1831kIM-ген, кодирующий метилазу Eco1831kI, обеспечивающий модификацию нуклеотидной последовательности CCSGG и защиту ДНК от расщепления рестриктазой Eco1831kI; ori репликон плазмиды рМВ1.

Способ конструирования плазмиды заключается в том, что плазмидную ДНК вектора pUC19 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции BamHI и соединяют с помощью ДНК-лигазы Т4 с природной плазмидой р1831, гидролизованной рестриктазой BglII. Смесь соединенных фрагментов трансформируют в клетки Escherichia coli К802. Трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших клонов, обнаруживших присутствие системы рестрикции- модификации Eco1831kI, выделяют плазмиду, обозначенную как pECO1831kI.

Предлагаемый штамм Escherichia coli K802 (pECO1831kI) продуцент эндонуклеазы рестрикции Eco1831kI был получен трансформацией плазмидной ДНК pECO1831kI в штамм Escherichia coli К802. Содержание рестриктазы Eco1831kI в предлагаемом штамме составляет 2500000 единиц на грамм сырой биомассы клеток.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИВФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ CR-368D.

Штамм Escherichia coli BKM CR-368D имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину, подвижные, грамотрицательные, с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные.

Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПВ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПВ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 50^оС, оптимальная температура роста 37^оС, оптимум рН 6,8-7,4.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Нитраты восстанавливают до нитритов.

Желатину не разжижают.

Индол не образуют.

Генетические признаки: hsdR⁺, hsdM⁺, gal^-, met^-, supE. Штамм проявляет устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pECO1831kI.

Условия хранения штамма:
Штамм бактерий Escherichia coli BKM CR-368D хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при -20-70^оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.

П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pECO1831kI.

Экстрахромосомальную ДНК, в частности, плазмиду р1831, выделенную из природного штамма E. coli 1831k, гдиролизуют рестриктазой BgIII при 37^оС в течение 1 ч в буфере, содержащем 10 мМ трис HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM дитиотреитола. Векторную плазмиду pUC19 гидролизуют рестриктазой BamHI в течение часа в буфере, указанном выше. Ферменты инактивируют экстракцией ДНК водонасыщенным фенолом и, после переосаждения этанолом, 2 мкг BgIII-гидролизата ДНК из E.coli 1831k смешивают с 0,2 мкг BamHI-гидролизата pUC19, добавляют АФТ до 5 мМ и проводят реакцию в присутствии 0,1 ед. ДНК-лигазы фага 14 при 10^оС 16 ч в буфере 66 мМ трис-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCL, 10 mM MgCl₂, 1mM дитиотреитола. Лигазу инактивируют прогреванием при 65^оС 10 мин и инкубационную смесь используют для трансформации компетентных клеток E.coli К802.

Среди трансформантов, выросших на селективной агаризованной среде с ампициллином (50 мкг/мл), отбирают клоны, содержащие систему рестрикции-модификации Eco1831kI.

П р и м е р 2. Получение и очистка рестриктазы.

Культуру клеток E.coli K802 (pECO1831kI) выращивают в 1 л LB-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптона на 1 л воды) при 37^оС до титра 2х10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, полученный экстракт центрифугируют при 48000g при 2^оС.

Для определения активности рестриктазы Eco1831kI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37^оС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 1,2% агарозном геле.

За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч.

Уровень активности рестриктазы Eco1831kI, определенный в бесклеточном экстракте штамма E.coli BKM CR-368D, составляет около 2500000 ед в пересчете на 1 г сырой клеточной биомассы.

Рекстриктаза Eco1831kI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонках с DEAE-целлюлозой и фосфоцеллюлозой с последующей хроматографией на гидроксилапатите и ДЕ-сферодексе. Препарат фермента окончательно концентрируют диализом против 50% глицерина. Выход очищенного фермента составляет 350000 ед/г биомассы.

Очищенный фермент стабилен при -20^оС в течение 6 мес. При 20^оС рестриктаза Eco1831kI сохраняет 95% своей активности в течение 14 дней, при 37^оС 50% в течение 14 дней, при 65^оС 95% в течение 60 мин. Рестриктаза пригодна для структурного анализа ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Eco1831kI и места гидролиза ДНК.

Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК pUC19 рестриктазой Eco1831kI, с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена тольк одна нуклеотидная последовательность 5'-CCSGG-3', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах первичной нуклеотидной последовательности pUC19 (п.н.): 49, 84, 414, 415, 1187, 1883 и 2234.

Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Eco1831kI используют ДНК pUС129. После отжига с универсальным синтетическим праймером (17-mer) и реакцией полимеризации матрицу обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Eco1831kI. Часть работы вторично подвергают полимеризации и оба полученных препарата исследуют в известных условиях, предложенных Simcox с соавторами. Четыре стандартные секвенирующие реакции проводят согласно известному протоколу Sanger с соавторами.

Проведенные опыты позволяют сделать вывод, что рестриктаза Eco1831kI является ложным изошизомером рестриктазы CauII и узнает последовательность нуклеотидов 5'-N/CCSGGN-3'.

Кроме того, полученная рестриктаза Eco1831kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции:
оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,2-8,5
оптимальная температура -37^оС
NaCl 20-120 мМ
Таким образом, получена рекомбинантная плазмида pECO1831kI, содержащая гены системы рестрикции-модификации (R-M) Eco1831kI. Данная плазмида обеспечивает уровень синтеза эндонуклеазы рестрикции не менее, чем в 30 раз выше природной плазмиды р1831, выделенной из штамма E.coli 1831k. Наличие детерминанты резистентности к ампициллину позволяет переносить плазмиду pECO1831kI путем трансформации в различные штаммы E.coli, оптимизировать культивирование целевых продуктов и выращивать штамм-продуцент в селективных условиях.

Полученный штамм E.coli BKM CR-368D, как продуцент специфической эндонуклеазы Eco1831kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 2500000 ед на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет 350000 ед/г биомассы, что в 5 раз выше, чем в случае прототипа CauII. Рекстриктаза Eco1831kI является не описанным ранее ложным изошизомером CauII, точкой расщепления перед первым 5^оС нуклеотидной последовательности 5'-N/COSGGN-3'. Рестриктаза Eco1831kI, в отличие от CauII, образует 5'-выступающие пентануклеотидные "липкие" концы, что существенно облегчает введение меченых нуклеотидов в районы сайтов Eco1831kI.

Использование: полученные плазмида и штамм могут быть использованы для получения эндонуклеазы рестрикции Eco 1831 к I, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-N/CCSGGN-3′,, которая может найти применение в генно - инженерных исследованиях. Сущность изобретения: полученная новая рекомбинантная плазмида pECO 1831 к I размером 8,1 т. п. н. содержит гены системы рестрикции - модификации Eco 1831 к I, состоит из BamH I - фрагмента вектора pUC 19 и Bgl II фрагмента природной плазмиды p 1831, содержит три участка узнавания рестриктазой EcoR I, два участка - Sty I, по одному участку для рестриктаз: Kpn I, Sal I, Hind III, Pst I, Sma I, детерминанту резистентности к ампициллину. Полученная плазмида обеспечивает повышенный синтез рестриктазы Eco 1831 кI. Предлагаемый штамм Escherichia coli BKM CR - 3680 Д, полученный трансформацией плазмидной ДНК pECO 1831 К I в штамм E. coli К 802 обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 2,5 млн. ед. на I г сырой биомассы. Выход очищенного фермента составляет 350000 ед/г биомассы. 2 с. п. ф-лы.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pECO1831kI, определяющая синтез эндонуклеазы рестрикции Eco1831kI размером 8,1 т.п.н., содержащая Bgl II-фрагмент ДНК природной плазмиды p1831 размером 5,4 т.п.н. с геном системы рестрикции-модификации Eco1831kI; BamHI-фрагмент ДНК векторной плазмиды puc19 размером 2,7 т. п.н.; - сайты рестрикции: - три участка узнавания рестриктазой Eco RI, расположенных на расстоянии 0,25; 1,2 и 6,65 т.п.н.; два участка узнавания рестриктазой StyI, расположенных на растоянии 1,9 и 6,2 т.п.н.; - уникальные участки узнавания рестриктаз Kpn I, Sal I, Hind III, Pst I, Sma I; - генетические маркеры: bla-ген, ответственный за синтез бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину; eco1831kIR-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции Eco1831kI, обеспечивающий ограничение фага диаметром 80 vir; eco1831KIM-ген, кодирующий метилазу Eco1831KI, обеспечивающий модификацию нуклеотидной последовательности CCSGG и защиту ДНК от расщепления рестриктазой ECO1831KI; ori-репликон плазмиды pMBI. 2. Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ CR-368D - продуцент эндонуклеазы рестрикции Eco1831kI.