ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECO27K1 Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/19 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-C! PyCGPuG-3' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Eco27kI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером известной рестриктазы AvaI и может найти применение в генно-инженерных исследованиях как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК.

Известны изошизомеры рестриктазы AvaI, выделенные из различных штаммов: Agmenellum quadruplicatum (PR-), Nostoc РСС7524.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм Escherichia coli RFL88 [1] продуцирующий рестриктазу Eco881, который является истинным изошизомером рестриктазы AvaI, и узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов ДНК 5'-C!PyCGPuG-3' [3] Выход фермента Eco881 не указан.

Задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с высоким выходом, быстро растущего на обычных питательных средах.

Предлагаемый штамм Escherichia coli 27k был получен в результате целенаправленного поиска штаммов-продуцентов рестриктаз среди клинических изолятов (г. Киев) при помощи разработанного метода тестирования активности в экстрактах, полученных из отдельно взятых колоний, выросших на агаризованной среде с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле. Содержание рестриктазы Eco27kI в предлагаемом штамме 500000 единиц/на грамм сырой биомассы клеток. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ В-2005Д.

Штамм Escherichia coli ВКМ В-2005Д имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину, подвижные, грамотрицательные, с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 50^оС, оптимальная температура роста 37^оС, оптимум рН 6,8-7,4. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, лагактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и натратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют.

Гинетические признаки. Клетки устойчивы к ампициллину (Am-20 мкг/мл), новобиоцину (Nb 20 мкг/мл), стрептомицину (Sm 20 мкг/мл).

Условия хранения штамма:
Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2005Д хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Штамм может храниться не менее года в 15% глицерине при -20-70^оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.

П р и м е р 1. Тестирование ферментов рестрикции. Для поиска рестриктаз использовали экспресс-метод, представляющий собой модификацию метода Белавина и соавт [3] Для этого одну-две большие колонии (около 5х10⁶ 1х10⁷ клеток) суспендируют в 20 мкл буфера А (20 мМ трис-HCl, рН, 7,6, 12,5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), содержащего 10 мг/мл лизоцима, и инкубируют при комнатной температуре (18^оС). Через 30 мин добавляют равный объем буфера В (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 2% тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанола) и инкубируют еще 60 мин при 4^оС. Клеточную суспензию (1 и 4 мкл) смешивают с 2 мкг ДНК фага диаметром 80 vir в 40 мкл буфера С (10 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCl). Гидролиз проводят при 37^оС в течение 10 мин. Кроме того, 4 мкл клеточной суспензии дополнительно инкубируют в 40 мкл буфера С без субстрата с целью проверки возможного наличия в растворе экстрахромосомной ДНК. Реакцию останавливают экстракцией равным объемом водонасыщенного фенола. Для электрофоретического анализа используют 20 мкл гидролизата.

П р и м е р 2. Получение и очистка рестриктазы.

Культуру клеток E.coli 27k выращивают в 1 л LB-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 мг NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37^оС до титра 4х10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, экстракт получают центрифугированием при 2^оС (48000g). Для определения активности рестриктазы Eco27kI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37^оС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч.

Уровень активности рестриктазы Eco27kI, определенный в бесклеточном экстракте штамма E.coli 27k, около 500000 ед в пересчете на 1 г сырой клеточной биомассы. Рестриктаза Есо27kI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонке с DEAE-целлюлозой с последующей хроматографией на DEAE-Toeyperl, SP-Toeyperl, гидроксилапатите и гепаринсефарозе. Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против буфера: 100 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 50% глицерин. Выход очищенного ф ермента составляет: 30000 ед на г сырой биомассы. Полученная рестриктаза Eco27kI характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК 5'-C! PyCGPuG-3'. Очищенный фермент при -20^оС в течение полугода сохраняет 95% своей активности. При 0^оС рестриктаза Eco27kI сохраняет 95% своей активности в течение 14 дней, при +65^оС теряет 95% своей активности в течение 15 мин. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Eco27kI и места гидролиза ДНК. Для определения последовательности узнавания рестриктазой проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭФМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность 5'-C!PyCGPuG-3', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах первичной нуклеотидной последовательности ДНК фага лямбда: 4721, 19398, 21000, 27888, 31618, 33499, 38215, 39889. Для подтверждения полученных данных проводят картирование участков узнавания рестриктазой Eco27kI на ДНК фага лямбда, используя совместный гидролиз рестриктазами: EcoRI и Eco27kI, BamHI и Eco27kI, CfrBI и Eco27kI.

Показано, что рестриктаза Eco27kI гидролизует эту ДНК в позициях, соответствующих районам гидролиза рестриктазой AvaI. Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Eco27kI была использована ДНК M13tg 130. После отжига с универсальным синтетическим праймером и реакции полимеризации матрицу обрабатывают эндонуклеазой рестриктации Eco27kI. Часть пробы вторично подвергали полимеризации и оба полученных препарата исследовали в условиях, предложенных Сэнгером [7] с использованием 8% денатурирующего полиакриламидного геля, что позволило определить место гидролиза.

Проведенные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза Eco27kI является истинным изошизомером рестриктазы AvaI и узнает последовательность нуклеотидов:
-5'-C!PyCGPuG-3'
Кроме того, полученная рестриктаза Eco27kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции: рН 7,5, 37^оС, 50 мМ NaCl.

Таким образом, полученный штамм Escherichia coli ВКМ В-2005Д, как продуцент специфической эндонуклеазы Eco27kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 500000 ед на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет 30000 ед на г биомассы клеток.

Использование: биотехнология для получения эндонуклеазы рестрикции Eco27K1, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-C!PyCGPuG-3′. Рестриктаза, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером рестриктазы AvaI и может найти применение в генно-инженерных исследованиях. Сущность изобретения: предлагаемый штамм Escherichia coli ВКМ В 200 5Д выделен из клинических изолятов ( г. Киев ) и обеспечивает высокий уровень содержания фермента не менее 500000 ед/г сырого вещества биомассы клеток. Выход очищенного фермента составляет 30000 ед/г биомассы клеток.

Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2005 продуцент эндонуклеазы рестрикции Есо 27К1.