СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к медико-биологическим наукам и клинической медицине, и может быть использовано для подготовки секционного материала для электронномикроскопического исследования нервной системы.

Традиционно считается, что электронномикроскопическое исследование (ЭМИ) секционного материала недостаточно информативно в связи с большим количеством артефактов, возникающих при посмертном взятии материала, и тем более, при первоначальной фиксации его в формалине.

В то же время нередко возникает необходимость использования секционного материала для изучения патогенеза таких заболеваний, как рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, наркомания, ишемический инсульт, опухоли нервной системы и других.

Известен целый ряд отечественных и зарубежных исследований, посвященных ЭМИ на секционном материале (Trump B.F. et al., 1975; Rees S., 1976; Hetzel W., 1980; Tumanov V.P., Zakharova O.A., Gel'fand V.B. 1994; Roberts R.C. et al., 1996; Kung L. et al., 1998; Tomilin V.V. et al., 1999; Leel-Ossy L., 2001 и др.). Однако в работах этих авторов информативность изображения была не совсем удовлетворительной.

Также известен способ подготовки несекционного материала нервной системы для ЭМИ, включающий фиксацию материала, обезвоживание в спиртах разной концентрации, пропитывание в ацетоне и смолах (Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А., 1994).

Недостатком ранее применявшегося способа является необходимость проведения ЭМИ секционного материала, взятого не позднее 12 часов после смерти, а также недостаточная сохранность и информативность полученного материала.

Техническим результатом изобретения является возможность проведения ЭМИ секционного материала нервной системы не только при его фиксации в первые 12 часов после смерти, но и на более поздних сроках - до 36 часов после смерти, с обеспечением максимальной сохранности материала и информативности при ЭМИ.

Указанный технический результат достигается в способе подготовки секционного материала для электронномикроскопического исследования (ЭМИ) нервной системы, включающий фиксацию материала, обезвоживание в спиртах разной концентрации, пропитывание в ацетоне и смолах, отличающийся тем, что предварительно секционный материал забирают не позднее 36 часов и первоначально фиксируют в 10 об.% нейтральном формалине, затем отмывают в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера с рН=7,2-7,4 по 1 часу, фиксируют в смеси равных количеств 2 об.% раствора четырехокиси осмия и 2 об.% раствора бихромата калия с добавлением к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 г сахарозы на 100 мл буфера с достижением 0,5 об.% итоговой концентрации четырехокиси осмия, причем время фиксации в этом растворе составляет от 3-х часов до 3-х суток; после осмиевой фиксации материал отмывают в 3-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера рН=7,2-7,4 с сахарозой по 1,5-2 часа в каждой, последнюю смену буфера производят без сахарозы, затем материал обезвоживают в спиртах, начиная с 50 об.% концентрации спирта - 2 смены по 30 минут и затем - в 70 об.% концентрации спирта - 2 смены по 1 часу, далее исследуемый материал контрастируют в 1-2 об.% растворе уранилацетата на 70 об.% спирте в течение 12-18 часов в холодильнике и осуществляют последующую обработку материала, включающую обезвоживание в спиртах 80 об.%, 96 об.% и 100 об.% по две смены, в первом спирте по 15 минут, в последних двух до 30 минут в каждом, и далее 2 смены в смеси спирта с ацетоном по 15 минут и в 3-х сменах чистого ацетона по 15 минут, после ацетона материал пропитывают смесью смол с ацетоном в последовательности - 1 часть смолы: 5 частей ацетона в течение часа; 1 часть смолы: 2 части ацетона не менее часа; смесь смол и ацетона в равном соотношении в течение 2 часов; 2 части смолы: 1 часть ацетона - в течение 2-2,5 часов; 5 частей смолы: 1 часть ацетона - на ночь, с последующим пропитыванием в чистой смоле без ацетона при комнатной температуре.

Способ иллюстрируется фиг. 1-10, где:

На фиг. 1 - последняя стадия митоза олигодендроцита в коре головного мозга. Я - ядра. Аутопсия. Ув. x9000.

На фиг. 2 - разделившиеся олигодендроциты в спинном мозге (эксперимент на крысах). Я - ядра. Ув. x9000.

На фиг. 3 - нейрон со складчатым ядром (Я) из гипоталамуса пациента с наркоманией. ЛФ - липофусцин. Аутопсия. Ув. x3150.

На фиг. 4 - нейрон со светлым ядром (Я) и плотным ядрышком (ядр) из паравентрикулярного ядра гипоталамуса крысы (эксперимент). Ув. x4000.

На фиг. 5 - синапс при болезни Паркинсона. 1 - синаптическая щель, М -митохондрии, СВ - синаптические везикулы. Аутопсия. Ув. x32000.

На фиг. 6 - синаптическая щель (стрелка, сщ) из биоптата белого вещества головного мозга при лейкодистрофии. Биопсия. Ув. x16000

На фиг. 7 - олигодендроцит в коре головного мозга пациента после инсульта на фоне сахарного диабета 2 типа с крупными фагосомами в цитоплазме. Я - ядро, Фс - фагосомы. Аутопсия. Ув. x8000.

На фиг. 8 - олигодендроцит с крупными фагосомами из глиомы головного мозга пациента после ее криодеструкции. Я - ядро, Фс - фагосомы. Биопсия. Ув. x10000

На фиг. 9 - сосуд капиллярного русла (С, стрелка) гипоталамической области головного мозга пациента с наркоманией. Аутопсия. Ув. x3150.

На фиг. 10 - сосуд из белого вещества пациента с глиомой головного мозга после ее криодеструкции. Э - эритроциты в виде монетного столбика (на обоих рисунках). Биопсия. Ув. x6000.

Как правило, взятие секционного материала для ЭМИ должно проводиться на сроках от 6 до 12 часов после смерти с целью сохранения качества и информативности. Однако не всегда бывает возможность выполнить взятие материала в установленные сроки по ряду причин. Это в свою очередь диктует необходимость усовершенствования методики подготовки секционного материала для ЭМИ на более поздних сроках. Наше изобретение основано на взятии секционного материала на сроках от 12 до 36 часов при аутопсии умерших пациентов с различной патологией (рассеянный склероз, наркомания, болезнь Паркинсона, инсульт, опухоли нервной системы и др.).

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Секционный материал, взятый для исследования (ткань головного или спинного мозга), первоначально фиксируют в 10% нейтральном формалине, отмывают в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера (рН=7,2-7,4) по 1 часу. После этого проводят фиксацию в смеси равных количеств 2% раствора четырехокиси осмия и 2% раствора бихромата калия и добавляют к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 гр сахарозы на 100 мл буфера. Итоговая концентрация четырехокиси осмия получается 0,5%. Время фиксации в этом растворе может варьировать от 3-х часов до 3-х суток, однако как правило, фиксация происходит в течение 18-20 часов при комнатной температуре.

После фиксации материал отмывают в 3-х сменах того же фосфатного буфера с сахарозой по 1,5-2 часа в каждой. Последняя смена буфера может быть без сахарозы как переходная для лучшего обезвоживания в спиртах, которое проводится в дальнейшем). Затем материал обезвоживают в спиртах, начиная с 50% (2 смены по 30 минут) и 70% (2 смены по 1 часу). После этого кусочки материала контрастируют в 1-2% растворе уранилацетата на 70% спирте, в течение 12-18 часов (ночь) в холодильнике.

Далее обработку материала осуществляют по стандартным для ЭМИ методикам (Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А., 1994). Подробное описание этой методики: на следующий день продолжают обезвоживание в спиртах (80%, 96% и 100% по две смены - в первом спирте по 15 мин., в последних двух до 30 мин в каждом) и далее в смеси спирта с ацетоном -2 смены и в 3-х сменах чистого ацетона (везде по 15 мин). После ацетона материал пропитывают смесью смол с ацетоном в такой последовательности: 1 ч. Смолы : 5 ч. ацетона около часа; 1 ч. Смолы : 2 ч. ацетона - не менее часа; смесь смол и ацетона в равном соотношении - 2 часа; 2 ч. Смолы : 1 ч ацетона -2-2,5 часа; 5 ч. Смолы : 1 ч. ацетона - на ночь. На следующий день продолжают пропитывание в чистой смоле без ацетона при комнатной температуре. Для улучшения процесса обезвоживания и пропитывания в смоле используют встряхиватель для жидкостей, на который ставят флакончики с материалом.

Смесь смол представляла собой либо аралдит М с аралдитом Н в соответствующих пропорциях с добавлением дибутилфталата и ускорителя для аралдита (Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А., 1994), либо смесь смол состояла из эпона, DDSA и аралдита М с добавлением дибутилфталата и ускорителя для эпона (ДМР-30).

Вечером того же дня кусочки раскладывают в капсулы или блистеры из-под таблеток, заполненные чистой смолой без ацетона с соответствующими подписями, и ставят в термостат на сутки при 37 градусах. При этом кусочки ориентируют нужным образом. Вечером следующего дня термостат, не открывая, переводят на температуру 60 градусов, при которой происходит полимеризация смолы с кусочками в течение 2-3-х суток. Затем термостат выключают, дают материалу остыть и примерно через сутки после этого изготавливают полутонкие и ультратонкие срезы. Далее снова все выполняют по стандартным для ЭМИ методикам (Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А., 1994).

Способ подтверждается следующими примерами с иллюстрациями аутопсийного (секционного) материала в сравнении с аналогичным материалом, полученным в результате биопсий и проведения экспериментов.

Пример 1 (фиг. 1). Пациент 3. с рассеянным склерозом. Взятие аутопсийного (секционного) материала головного мозга выполнено через 24 часа после смерти. Первоначальная фиксация материала выполнялась в 10% нейтральном формалине. Затем материал отмывали в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера с рН=7,2-7,4 по 1 часу. Затем выполнялась фиксация в смеси равных количеств 2% раствора четырехокиси осмия и 2% раствора бихромата калия с добавлением к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 г сахарозы на 100 мл буфера с достижением 0,5% итоговой концентрации четырехокиси осмия, причем время фиксации в этом растворе составляло 2 суток. После осмиевой фиксации материал отмывали в 3-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера (рН=7,2-7,4) с сахарозой по 1,5 часа в каждой. Последнюю смену буфера производили без сахарозы. Затем материал обезвоживали в спиртах, начиная с 50% концентрации спирта - 2 смены по 30 минут и затем - в 70% концентрации спирта - 2 смены по 1 часу. Далее исследуемый материал контрастировали в 1-2% растворе уранилацетата на 70% спирте в течение 12 часов в холодильнике. Последующую обработку материала осуществляли по стандартной методике ЭМИ, включавшей дальнейшее обезвоживание, пропитывание ацетоном и смолами. На представленном изображении (фиг. 1) при ЭМИ отчетливо различимы структуры олигодендроцита, а именно последняя стадия митоза олигодендроцита в коре головного мозга. В сравнении с изображением (фиг. 2) при ЭМИ материала, полученного в эксперименте, где различимы структуры разделившихся олигодендроцитов, отчетливо видно высокое качество и информативность полученных результатов.

Пример 2 (фиг. 3). Пациент К. Наркомания. Взятие аутопсийного (секционного) материала головного мозга выполнено через 36 часов после смерти. Первоначальная фиксация материала выполнялась в 10% нейтральном формалине. Затем материал отмывали в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера с рН=7,2-7,4 по 1 часу. Затем выполнялась фиксация в смеси равных количеств 2% раствора четырехокиси осмия и 2% раствора бихромата калия с добавлением к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 г сахарозы на 100 мл буфера с достижением 0,5% итоговой концентрации четырехокиси осмия, причем время фиксации в этом растворе составляло 3 суток. После осмиевой фиксации материал отмывали в 3-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера (рН=7,2-7,4) с сахарозой по 2 часа в каждой. Последнюю смену буфера производили без сахарозы. Затем материал обезвоживали в спиртах, начиная с 50% концентрации спирта - 2 смены по 30 минут и затем - в 70% концентрации спирта - 2 смены по 1 часу. Далее исследуемый материал контрастировали в 1-2% растворе уранилацетата на 70% спирте в течение 18 часов в холодильнике. Последующую обработку материала осуществляли по стандартной методике ЭМИ, включавшей дальнейшее обезвоживание, пропитывание ацетоном и смолами. На представленном изображении (фиг. 3) при ЭМИ аутопсийного материала отчетливо различим нейрон гипоталамуса со складчатым ядром, включения липофусцина и миелиновые волокна. В сравнении с изображением (фиг. 4) при ЭМИ материала, полученного в эксперименте, где представлен нейрон со светлым ядром и плотным ядрышком из паравентрикулярного ядра гипоталамуса, отчетливо видно высокое качество и информативность полученных результатов.

Пример 3 (фиг. 5). Пациент Л. Болезнь Паркинсона. Взятие аутопсийного (секционного) материала головного мозга выполнено через 36 часов после смерти. Первоначальная фиксация материала выполнялась в 10% нейтральном формалине. Затем материал отмывали в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера с рН=7,2-7,4 по 1 часу. Затем выполнялась фиксация в смеси равных количеств 2% раствора четырехокиси осмия и 2% раствора бихромата калия с добавлением к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 г сахарозы на 100 мл буфера с достижением 0,5% итоговой концентрации четырехокиси осмия, причем время фиксации в этом растворе составляло 3 суток. После осмиевой фиксации материал отмывали в 3-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера (рН=7,2-7,4) с сахарозой по 2 часа в каждой. Последнюю смену буфера производили без сахарозы. Затем материал обезвоживали в спиртах, начиная с 50% концентрации спирта - 2 смены по 30 минут и затем - в 70% концентрации спирта - 2 смены по 1 часу. Далее исследуемый материал контрастировали в 1-2% растворе уранилацетата на 70% спирте в течение 18 часов в холодильнике. Последующую обработку материала осуществляли по стандартной методике ЭМИ, включавшей дальнейшее обезвоживание, пропитывание ацетоном и смолами. На представленном изображении (фиг. 5) при ЭМИ аутопсийного материала головного мозга отчетливо виден синапс (синаптическая щель, синаптические везикулы), митохондрии. В сравнении с изображением (фиг. 6) при ЭМИ материала, полученного при биопсии белого вещества, где представлен синапс (синаптическая щель), отчетливо видно высокое качество и информативность полученных результатов.

Пример 4 (фиг. 7). Пациент С. Ишемический инсульт на фоне сахарного диабета 2 типа. Взятие аутопсийного (секционного) материала головного мозга выполнено через 24 часов после смерти. Первоначальная фиксация материала выполнялась в 10% нейтральном формалине. Затем материал отмывали в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера с рН=7,2-7,4 по 1 часу. Затем выполнялась фиксация в смеси равных количеств 2% раствора четырехокиси осмия и 2% раствора бихромата калия с добавлением к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 г сахарозы на 100 мл буфера с достижением 0,5% итоговой концентрации четырехокиси осмия, причем время фиксации в этом растворе составляло 3 суток. После осмиевой фиксации материал отмывали в 3-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера (рН=7,2-7,4) с сахарозой по 2 часа в каждой. Последнюю смену буфера производили без сахарозы. Затем материал обезвоживали в спиртах, начиная с 50% концентрации спирта - 2 смены по 30 минут и затем - в 70% концентрации спирта - 2 смены по 1 часу. Далее исследуемый материал контрастировали в 1-2% растворе уранилацетата на 70% спирте в течение 18 часов в холодильнике. Последующую обработку материала осуществляли по стандартной методике ЭМИ, включавшей дальнейшее обезвоживание, пропитывание ацетоном и смолами. На представленном изображении (фиг. 7) при ЭМИ аутопсийного материала коры головного мозга отчетливо виден олигодендроцит с крупными фагосомами в цитоплазме. В сравнении с изображением (фиг. 8) при ЭМИ материала, полученного при биопсии головного мозга во время проведения криодеструкции глиомы, где представлен олигодендроцит с аналогичными крупными фагосомами, отчетливо видно высокое качество и информативность полученных результатов.

Пример 5 (фиг. 9). Пациент И. Наркомания. Взятие аутопсийного (секционного) материала головного мозга выполнено через 24 часов после смерти. Первоначальная фиксация материала выполнялась в 10% нейтральном формалине. Затем материал отмывали в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера с рН=7,2-7,4 по 1 часу. Затем выполнялась фиксация в смеси равных количеств 2% раствора четырехокиси осмия и 2% раствора бихромата калия с добавлением к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 г сахарозы на 100 мл буфера с достижением 0,5% итоговой концентрации четырехокиси осмия, причем время фиксации в этом растворе составляло 12 часов. После осмиевой фиксации материал отмывали в 3-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера (рН=7,2-7,4) с сахарозой по 1,5 часа в каждой. Последнюю смену буфера производили без сахарозы. Затем материал обезвоживали в спиртах, начиная с 50% концентрации спирта - 2 смены по 30 минут и затем - в 70% концентрации спирта - 2 смены по 1 часу. Далее исследуемый материал контрастировали в 1-2% растворе уранилацетата на 70% спирте в течение 12 часов в холодильнике. Последующую обработку материала осуществляли по стандартной методике ЭМИ, включавшей дальнейшее обезвоживание, пропитывание ацетоном и смолами. На представленном изображении (фиг. 9) при ЭМИ аутопсийного материала гипоталамической области головного мозга отчетливо виден сосуд капилярного русла, эритроциты в виде монетного столбика. В сравнении с изображением (фиг. 10) при ЭМИ материала, полученного при биопсии головного мозга во время проведения криодеструкции глиомы, где представлен сосуд из белого вещества головного мозга, а также эритроциты в виде монетного столбика, отчетливо видно высокое качество и информативность полученных результатов.

Представленные примеры подтверждают высокую информативность способа и наглядно демонстрируют возможность применения в научной и медицинской практике заявляемого способа обработки для ЭМИ секционного материала.

Заявляемый способ обеспечивает возможность проведения ЭМИ секционного материала нервной системы не только при его фиксации в первые 12 часов после смерти, но и на более поздних сроках - до 36 часов после смерти, с обеспечением максимальной сохранности материала и информативности при ЭМИ.

Изобретение относится к медицине, а именно к медико-биологическим наукам и клинической медицине, и может быть использовано для подготовки секционного материала для электронномикроскопического исследования (ЭМИ) нервной системы. Способ подготовки секционного материала для электронномикроскопического исследования (ЭМИ) нервной системы включает фиксацию материала, обезвоживание в спиртах разной концентрации, пропитывание в ацетоне и смолах. При этом предварительно секционный материал забирают не позднее 36 часов и первоначально фиксируют в 10 об.% нейтральном формалине, затем отмывают в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера с рН=7,2-7,4 по 1 часу, фиксируют в смеси равных количеств 2 об.% раствора четырехокиси осмия и 2 об.% раствора бихромата калия с добавлением к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 г сахарозы на 100 мл буфера с достижением 0,5 об.% итоговой концентрации четырехокиси осмия, причем время фиксации в этом растворе составляет от 3-х часов до 3-х суток; после осмиевой фиксации материал отмывают в 3-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера рН=7,2-7,4 с сахарозой по 1,5-2 часа в каждой, последнюю смену буфера производят без сахарозы, затем материал обезвоживают в спиртах, начиная с 50 об.% концентрации спирта - 2 смены по 30 минут и затем - в 70 об.% концентрации спирта - 2 смены по 1 часу, далее исследуемый материал контрастируют в 1-2 об.% растворе уранилацетата на 70 об.% спирте в течение 12-18 часов в холодильнике. После этого осуществляют обработку материала, включающую обезвоживание в спиртах 80 об.%, 96 об.% и 100 об.% по две смены, в первом спирте по 15 минут, в последних двух до 30 минут в каждом, и далее 2 смены в смеси спирта с ацетоном по 15 минут и в 3-х сменах чистого ацетона по 15 минут, после ацетона материал пропитывают смесью смол с ацетоном в последовательности - 1 часть смолы : 5 частей ацетона - в течение часа; 1 часть смолы : 2 части ацетона - не менее часа; смесь смол и ацетона в равном соотношении в течение 2 часов; 2 части смолы : 1 часть ацетона - в течение 2-2,5 часов; 5 частей смолы : 1 часть ацетона - на ночь, с последующим пропитыванием в чистой смоле без ацетона при комнатной температуре. Изобретение обеспечивает возможность проведения ЭМИ секционного материала нервной системы не только при его фиксации в первые 12 часов после смерти, но и на более поздних сроках - до 36 часов после смерти, с обеспечением максимальной сохранности материала и информативности при ЭМИ. 10 ил., 5 пр.

Способ подготовки секционного материала для электронномикроскопического исследования (ЭМИ) нервной системы, включающий фиксацию материала, обезвоживание в спиртах разной концентрации, пропитывание в ацетоне и смолах, отличающийся тем, что предварительно секционный материал забирают не позднее 36 часов и первоначально фиксируют в 10 об.% нейтральном формалине, затем отмывают в 4-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера с рН=7,2-7,4 по 1 часу, фиксируют в смеси равных количеств 2 об.% раствора четырехокиси осмия и 2 об.% раствора бихромата калия с добавлением к этой смеси такого же количества фосфатного буфера с сахарозой в разведении 9 г сахарозы на 100 мл буфера с достижением 0,5 об.% итоговой концентрации четырехокиси осмия, причем время фиксации в этом растворе составляет от 3-х часов до 3-х суток; после осмиевой фиксации материал отмывают в 3-х сменах натрий-калиевого фосфатного буфера рН=7,2-7,4 с сахарозой по 1,5-2 часа в каждой, последнюю смену буфера производят без сахарозы, затем материал обезвоживают в спиртах, начиная с 50 об.% концентрации спирта - 2 смены по 30 минут и затем - в 70 об.% концентрации спирта - 2 смены по 1 часу, далее исследуемый материал контрастируют в 1-2 об.% растворе уранилацетата на 70 об.% спирте в течение 12-18 часов в холодильнике и осуществляют последующую обработку материала, включающую обезвоживание в спиртах 80 об.%, 96 об.% и 100 об.% по две смены, в первом спирте по 15 минут, в последних двух до 30 минут в каждом, и далее 2 смены в смеси спирта с ацетоном по 15 минут и в 3-х сменах чистого ацетона по 15 минут, после ацетона материал пропитывают смесью смол с ацетоном в последовательности - 1 часть смолы : 5 частей ацетона - в течение часа; 1 часть смолы : 2 части ацетона - не менее часа; смесь смол и ацетона в равном соотношении в течение 2 часов; 2 части смолы : 1 часть ацетона - в течение 2-2,5 часов; 5 частей смолы : 1 часть ацетона - на ночь, с последующим пропитыванием в чистой смоле без ацетона при комнатной температуре.