1 ,
Изобретение относится к биохимии, в частности к витаминологии, и может быть использовано-при определении количественного содержания тиамина в биологических материалах, в витаминных препаратах, продуктах питания и кормах.
Цель изобретения - увеличение чувствительности и точности способа.
Пример 1. Инкубационную среду, содержащую 0,7 мл фосфатного буфера 0,2 М, с рН 6,0-7,0; 0,075 мл никотинамида; 0,025 мл меченного тиамина по тиазолу С и 0,1 мл анализируемой пробы, помещают в емкость со льдом и водой и охлаждают до . После охлаждения среды до указанной температуры, с целью проведения ферментативной реакции в инкубационную среду вносят фермент тиаминазу 1 в объеме О,1 мл, полученный из мьшщ пресноводных двустворчатых моллюсков Anodonta cygnea, и проводят инкубацию
среды в течение 1 мин при 0°С. Фер- ментат шная реакция сопровождается увеличением скорости образования продукта реакции - тиазола, который выделяется в инкубационную среду.
Остановку реакции с одновременным отделением продукта реакции от меченного субстрата - тиамина, известное количество которого содержится в инкубационной среде, проводят путем добавления в среду 2 мл этилацетата (соотношение объемов среды и экстр- агента 1:2) и проводят интенсивное перемешивание содержимого емкости встряхиванием. При этом происходит селективное экстрагирование продукта реакции - тиазола в этилацетатную фазу, а тиамин остается Р водной фазе. Для разделения фаз проводят центрифугирование среды при 3000 об/мин в течение 3 мин.
После разделения 0,5 мл этилацетата, содержащего тиазол, нносят в
€
(Л
с
N
О5
ел
о to
U65762
диоксановый сцинтиллятор (5 мл) для определения радиоактивности продукта реакции. Радиометрическое измерение проводят на жидкостном сцинтилляци- онном спектрометре. Для определения общего тиамина строят калибровочный график зависимости количественного образования тиазона при известной концентрации тиамина.
Построение калибровочной кривой. В двойной ряд пробирок, помещенных в водяную баню, разливают по 0,1 мл водного стандартного раствора нений радиоактивности продукта реакции тиазола (Cj,) без разведения меткн (контроль) к С - значению радиоактивности продукта реакции тиазола при разведении метки нерадиоактивным тиамином в инкубационной среде.
Пример 2.К1МЛ мочи вносят 50 мг активированного угля. Угол ТО отделяют центрифугированием. Десорбцию тиамина с угля проводят 2 мл подкисленного метанола. Полученный экстракт высушивают под струей воздуха. Осадок растворяют в О,2 мл
водного стандартного раствора не- г
радиоактивного тиамина. Концентрация , дистиллированной воды. 0,1 « t и -ттпт,чллот пля анализа. После
тиамина в водном растворе в каждой пробирке составляет, мкМг 0,15; О.,3; 0,6; 1,5; 3,0; 6,0. В одну пару пробирок (контроль) вместо стандартного раствора тиамина вносят по 0,1 мл воды. В каждую пробирку дабавляют по 0,1 мл водного раствора, содержащего 2,4 мкМ С -тиамина, разведенного так, чтобы общее число импульсов в пробе составляло 100000 импульсов за 1 мин. В каждую пробир- .ку приливают по 0,6 мл 0,2 М раство- .ра натрий фосфатного буфера (рН 6,4) Содержимое пробирок перемешивают. В каждую пробирку вносят .одинак овое количество тиаминазы (0,0025 ME) в объеме 0,2 мл. Приготовленные пробы инкубируют в течение 1 мин при О С, после чего останавливают реакцию. Разделение фаз после встряхивания в течение 3 мин достигают центрифугированием при 1500а в течение 10 мин. 0,5 мл этйлацетата, содержащего продукт реакции - тиазол, отбирают из всех проб для подсчета радиоактивности.
Строят калибровочный график, где по оси абсцисс откладьшают значения нерадиоактивного тиамина в инкубационной среде в мкМ (0;0,15;0,3.,.) а по оси ординат - значения отноше20
вора используют для анализа. После проведения в инкубационной среде ферментативной реакции, амплитуду всплеска образования тиазола фиксируют счетчиком.
. Зная значения Сс (контроль) и С находят отношение Со/Сх. Получают соответствующую этому значению точ- 25 ку на калибровочной кривой. Этой точке соответствует искомое значение концентрации общего тиамина в анализируемой пробе на оси абсцисс.
30
35
Формула изобретени
Способ определения концентрации общего тиамина, предусматривающий приготовление стандартного образца и исследуемой пробы, введение в них специфического, реагента, инкубирование с образованием каталитических продуктов и последуюш,йм сопоставлением их концентраций, отличаю щ и и с я тем, что, с целью увеличения точности и чувствительности, в качестве стандартного образца используют тиамин, меченный по С , и .специфический реагент-тиаминазу при этом инкубацию осуществляют при 5 0-4 С.
40
62
ний радиоактивности продукта реакции тиазола (Cj,) без разведения меткн (контроль) к С - значению радиоактивности продукта реакции тиазола при разведении метки нерадиоактивным тиамином в инкубационной среде.
Пример 2.К1МЛ мочи вносят 50 мг активированного угля. Угол ТО отделяют центрифугированием. Десорбцию тиамина с угля проводят 2 мл подкисленного метанола. Полученный экстракт высушивают под струей воздуха. Осадок растворяют в О,2 мл
г
, дистиллированной воды. 0,1 « и -ттпт,чллот пля анализа. После
дистиллированной воды. 0,1 « и -ттпт,чллот пля анализа. После
вора используют для анализа. После проведения в инкубационной среде ферментативной реакции, амплитуду всплеска образования тиазола фиксируют счетчиком.
. Зная значения Сс (контроль) и С находят отношение Со/Сх. Получают соответствующую этому значению точ- ку на калибровочной кривой. Этой точке соответствует искомое значение концентрации общего тиамина в анализируемой пробе на оси абсцисс.
30
35
Формула изобретения
Способ определения концентрации общего тиамина, предусматривающий приготовление стандартного образца и исследуемой пробы, введение в них специфического, реагента, инкубирование с образованием каталитических продуктов и последуюш,йм сопоставлением их концентраций, отличаю- щ и и с я тем, что, с целью увеличения точности и чувствительности, в качестве стандартного образца используют тиамин, меченный по С , и .специфический реагент-тиаминазу 1, при этом инкубацию осуществляют при 5 0-4 С.
40
Изобретение относится к области биохимии, в частности к витаминологии, и может быть использовано при определении количественного содержания тиамина в биологических материалах, в витаминных препаратах, продуктах питания и кормах. Целью изобретения является повышение чувствительности и точности способа. Для зтого готовят стандартный образец тиамина, меченного по С , и исследуемую пробу вводят в них специфический реа- гент-тиаминазу 1, инкубируют при 0-4 С с образованием каталитических продуктов и последующим сопоставлением их концентраций.
