Способ определения фибронектина в плазме крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для коли- чественного определения фибронектина в плазме крови.

Цель изобретения - повышение чувствительности и точности способа, его упрощение.

Способ осуществляют следз кнцим образом.

Предварительно адсорбированные пробы плазмы испытывают в трехкомпо- нентной серологической реакции нейтрализации антител с дозированным количеством специфической антисьшорот- ки против фибронектина и стабильным диагностикумом, полученным в.результате последовательного сведения стабилизированных альдегидом эритрощ тов, дубильной кислоты и фибронектина, с последующей фиксацией образовавшегося комплекса альдегидом.

В предлагаемом способе испытуемые пробы плазмы, которые взаимодействуют со специфической антисьтороткой, а результат - нейтрализация антител - проверяются с помощью специфического стабильного фибронектинового эритро- цитарного диагностикума. Срок хранения фибронектинового эритроцитарного диагностикума - 6 мес (срок наблюдения).

Пример. Испытуемые образцы плазмы крови разводят 1:2 - 1:4, соединяют со взвесью отмытых формалинизированных эритроцитов, инкубируют 1 ч в тепле и затем до утра на холоде

4ib

а ел

О5

со

для удаления гетерогемагглютининов. Такая обработка не снижает содержани фибронектина в плазме.

В качестве референс-препарата применяют стагщартный раствор фибронектина с концентрацией 450 мкг/мп, параллельно с испытуемой пробой участ- вугаций в определении содержания фибронектина, Антисьторотку получают пу тем гипериммунизации кроликов фибро- нектином.

Для осуществления способа определения фибрснектина в плазме крови готовят фибронектиновый эритроцитарный диагностикум: полученную кровь (барана, петуха, человека - О группы) де- фибринируют, осадок эритроцитов от мьшают изотоническим солевым раствором, затем ресуспендируют до 8%-ной концентрации, взвесь соединяют с равным объемом изотонического раствора, содержащего 3% формальдегида, и инкубируют при 37 18 ч.

Затем формалинизированные эритроциты отмывают изотоническим солевым раствором, доводят до 20%-ной концентрации таким же раствором с 0,3% формальдегида и оставляют на холоде |На несколько дней (полуфабрикат). Сенситином служит фибронектин, выделенный из плазмы крови человека или животного (лошади) посредством аффинной хроматографии на желатин-ага- розе с этапом дополнительной очистки злюата по известной методике.

Полученные образцы фибронектина в дозах 10, 25 и 50 мкг сводят с 5%-но взвесью эритроцитов (формалинизирован ных, отмытых детергентсодержапщм солевым раствором (твин-80 1;50000) и Обработанных дубильной кислотой (Is :20 000.). Инкубирование фибронектина и эритроцитов при рН 6,4, 7,4, и 7,8, при 37° продолжают в течение 1,2 или 3 ч или при 18 ч. Сравнение серий, полученных щ:)и разных условиях изготовления, не выявляет различий в характеристике конечного продукта.

Эритроцитарный диагностикум стандартизируют по густоте на ФЭК-М и применяют как 2,5%-ный в макро- и как 0,3%-ный - в микрометоде реакщщ нейтрализации антител.

Количественное содержание фибронектина плазмы крови определяют сравнением нейтрализунмцего титра референспрепарата и иссле/ уемой пробы плазмы крови по формуле:

2 .Y

л/

X Y

где X, Y - концентра1щя фибронектина в исследуемой плазме и референс-препарате, соответственно;X ,Y - нейтрализующие титры.

5

5 0

0

5

0

5

Воспроизводимость способа проверяют на 4 образцах плазмы, в которых определенно содержание фибронектина предлагаемым способом не менее 4 раз с использованием антисыворотки в разведениях от 1:160 до 1:51200 с интервалом в 1-2 дня. Полученные результаты совпадают (коэффициент корреляции 1,0 против 0, 9, в аналогичных опытах, в,прототипе).

Предлагаемьй способ определения фибронектина в плазме крови обеспечи-. вает по сравнению с известными способами следующие преимущества: большую специфичность за счет использования в качестве ингредиентов очищенного фибронектина и специфической антисы- воротки; большую результативность за счет выявления полимеров, мономеров

0 и.продуктов деградации фибронектина; большую чувствительность за счет дозированного количества антител и прочности связи их с фибронектином; техническую простоту выполнения; выg.coKym воспроизводимость результатов за счет использования стабильного зритроцитарного диагностикума единой активности и дозированных антител; доступность и экономичность (стоимость 1 анализа - около 1 коп.);уменьшение объема крови, достаточного для определения концентрации фибронектина (менее 10 мкл„)

Повышегше чувствительности дает применение дозированного количества специфических антител, минимального, но достаточного для осуществления способа. Точность повышается за счет реализации связьшания многих мест связывания в молекуле фибронектина со специфическими антителами, 4to позволяет определить содержание всего иммунолопнчески активного фибронектина, вплоть до гаптенов. Воль-. шая чувствительность обеспечивается также более прочной связью фибронектина в плазме крови с антителами по .сравнению с желатиной и достигает 0,1-0,5 мкг/мл в предлагаемом способе

514657696

(7,0-60,0 мкг/ьш по прототипу), Вцию эритрощ1тов белком, добавление

прототипе используют нативные эритро- ,-их в исследуемую пробу с последующим

циты, что приводит к частому приго-определением по агглютинации эритротовленйю и стандартизации субстратовцитов содержания фибронектина, о треакции, что значительно усложняет .личающийся тем, что, с цель,

определение .фибронектина в клинике;повышения точности способа и его упв предлагаемом способе для этих це-рощения, эритроциты сенсибилизируют

лей применяют стандартные формалини-фибронектином, а перед добавлением их

зирозанные эритроциты. исследуемую пробу плазму адсорбиру1 ормула изобретенияют несенсибнпизированными эритроциСпособ определения фибронектина втами и вносят специфические антиппазме крови, включаизщий сенсибилиза-тела.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения фибронекти- на в плазме крови. Цель - повышение чувствительности, точности способа и его упрощение. В предварительно адсорбированные пробы плазмы крови вносят специфические антифибринонектино- вые антитела, эритроцитарньй диагно- стикум и по образованию агглютинатов определяют содержание фибронектина. Эритррцитарный диагностикум приготовляют из формалинизированных эритроцитов в присутствии дубильной кислоты. Сенситином является фибронектин, выделенный из крови человека или лошади,. В сравнении с прототипом обеспечиваются чувствительность (более чем в 70- 120 раз), точность способа и достигается его упрощение. о (Л