Способ получения пептидов или их кислотно-аддитивных солей Советский патент 1989 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

I

Изобретение относится к способу получения пептидов или их кислотно- аддитивных солей - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - способ получения новых производных в ряду пептидов, малотоксичных и обладающих высокой противодиарейной, противокашле вой и анальгетической активностью.

Приняты следующие сокращения: DMF - диметилформамид; THF - тетра- гидрофуран; DCC1 - дициклогексил- карбодиимид; НОВТ - 1 -оксибензотри- азол; - Ы-метилморфолин DCV 2

-дициклогексилмочевина; БОС - третичный бутилоксикарбонил.

Хроматографию осуществляют в тонком слое силикагеля на пластинах фирмы Merc с использованием следующих систем растворителей.

2. Смесь «-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 3:1:1. v 3. Хлороформ:метанол:32%-ная уксусная кислота 120:90:40, метанолг32%-ный аммиак 120:90.40.

7.Смесь хлороформа, метанола и 32%-ного водного раствора уксусной кислоты в соотношении 120:90:5.

8.Смесь хлороформа, метанола и

О 880 аммиака в соотношении 120:Уи:з.

4

СО

Ы

Высокоразрешающую жидкостную хроматографию проводят на колонках: Zor-вах С-8, 4,6 мм х 25 см, в качестве подвижной фазы используют

Туг

3i-Het

смесь ацетонитрила и 0,1 М ацетата аммония, рН 4,0. Скорость протока 2 мл/мин, определение при длине волны 254 нм,

П1.

Изобретение касается производства пептидов, в частности пептида ф-лы I H-Tyr-X-Gly-Phe(4-NO,)-Pro-- -NH , где X D-Met или D-Met(O), или их кислотно-аддитивных солей, которые как биологически-активные не- I mecTsa могут быть использованы в медицине. Цель - создание новых более активных и менее токсичных веществ указанного класса. Синтез пептида ведут реакцией трипептида II с дипеп- тидом III Boc-Tyr-X-GlyOH (И) и H-phe(4-N02)-Pro-Y (III), где X - указано-, Y Ш или ОСН,. ПолученГогГа - О с11 о брГоа ы Г2иа-.. koM (перевод в КН.,-группу) с последующим отщеплением защитной группы (Вое) и вьщелением целевого продукта в свободном виде или в виде кислотно-аддитивной соли. Новые пептиды обладают противодиарейной, противо- кашлевой и анальгетической активностями при дозах 0,02-0,03 мг/кг, 10 мг/кг и 50 мг/кг соответственно при токсичности LDjo 500 мг/кг. 1 табл,

пример 1. H-Tyr-DMet(0)-Gly- -Phe(4NOj)ProNHa.

BOC-D-Met. Gly. ОМе (1).

СНА-СОЛЬ BOC-D-Мет (28,38 г) сус- 45 пендируют в этилацетате (150 мл) и смешивают полученную суспензгао с раствором KHSO. (13,5) в воде (75 мл). После полного растворения органическую фазу отделяют, дважды 50 промывают водой (2x60 мл), высушивЬ- ют над безводным MgS04 и концентрируют. Полученную маслянистую жидкость растворяют в тетрагидрофуране (90 мл), охлаждают раствор до -25 С и обраба- /55 тывают N-диметилморфолином (6,66 г) и изобутилхлорформиатом (8,60 г). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 мин при и затем обрабатывают предварительно охлажденный до -25°С раствором Gly (7,53 г) и N-метилморЬолина (6,06 г) в диметилформамиде (90 мл). После выf

держки в течение 2 ч при -15 С реакционную смесь переносят в ледяную баню, обрабатывают 2 М раствором KHCOj (72 мл) и перемешивают в течение 30 мин. После этого растворитель отгоняют в вакууме, а остаток распределяют между этипацетатом (350 мл) и водой (75 мл). Органический слой затем промывают 5%-ньм раствором лимонной кислоты ( мл), 5%-ным раст раствором NaHCO) (2«50 мл) и водой ( мл). Экстракт высушивают над безводным MgSO и уп;аривают досуха, после чего сухой остаток растирают с петролейным эфиром.

15

Выход: 18,12 г (94% от теоретич.). Результаты тонкослойной хроматографии: одно пятно в 2,7,8.

Н D-Met,Gly, ОМе.НС (2).

BOC-D-Met.Gly.OMe (1) (18,1 г) суспендируют в анизоле (150 мл) и обрабатывают полученную суспензию смесью М НС1 и уксусной кислоты , (440 мл). Смесь перемешивают при .ком- натной температуре в течение 30 мин. Образующийся продукт осаждают путем добавления сухого эфира, отделяют его фильтрацией и тщательно промьша- ют сухим эфиром. Полученный сырой продукт растворяют в воде (450 мл) и раствор дважды промывают эфиром для удаления остатков анизола. Водный раствор вымораживают. В результате получают 13,77т продукта (выход 95% от теоретич.). Результаты тонкослойной хроматографии: чистьй

продукт (2,7,8).

BOC,-Tyr D-Met.Gly..OMe (3). ВОСТ-Туг (16,59 г) растворяют в тетрагидрофуране (80 мл), охлаткдают до -25°С и добавляют к нему N-метил- морфолин (5,96 г), а затем при быстром перемешивании изобутилхлорфор- миат (7,69 г). После выдержки в течение 2 мин при к смеси добавляют предварительно охлажденный раствор D-Met,.Gly,.ОМе.НС (13,77 г) и N-метилхлорформиата (5,42 г) в ди- метилформамиде (80 мл) и продолжают перемешивание при -15 С в течение 2,5 ч. Затем смесь помещают в ледяную баню и обрабатывают в течение 30 мин 2 М раствором КНСОз (65 мл). Остаток, полученный после отгонки растворителей в вакууме, растворяют в смеси этилацетата (360 мл) и воды (70 мл). Органическую фазу отделяют и промывают 5%-ньм раствором лимонной кислоты (2-50 мл), 5%-ным раствором NaHCOj (2 «50 мл) и водой (2 50 мл). После высушивания (MgS04).и удаления растворителя твердый остаток растирают с эфиром. В результате получают 21,16 г (81,6% от теоретилируют с помощью тонкослойной хроматографии (7). Установлено, что реакция заканчивается через 45 мин. Пос ле окончания реакции метанол отгоняют в вакууме, водный раствор охлаж- .дают льдом и нейтрализуют 1 М раствором НС1 (110 мл). Выпадающий в осадок продукт отфильтровывают, промывают несколько раз водой и высушивают над Ра05. Выход: 20,18 г (98% от теоретич.). Результаты тонкослойной хроматографии: одно пятно в 2,7,8.

Рассчитано,%: С 53,73; Н 6,6Г, N 8,96.

CiiH3,NjO-,S

Найдено,%: G 53,55; Н 6,62, N 8,76.

BOC-Tyr.D-Met(O). Gly (5). Раствор BOC-Tyr.D-Met.Gly ( 5,48) 20 в метаноле (120 мл) обрабатывают

двумя эквивалентами перекиси водорода (2,7 мл 29,4%-ного раствора). Протекание реакции контролируют с помощью высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии. После выдержки смеси в течение 20 ч при комнатной температуре ее упаривают досуха и растирают остаток с эфиром. Вы- xo;f: 5,46 г (96,5% от теоретического). Т.пл. 186-188°С (с разложением).

25

30

г -,5.5

формамид).

.

1,0° (, диметил- 1,3 (С 1, диметил формамид).,

Рассчитано,%: С 51,96, Н 6,39, N 8,66.

С ,,Н 5,Ы50„3

40

Найдено, %: С 52,13, Н 6,38;

N 8,53.

BOC-Phe(NO,2) .Рго.ОМе (в).

BOC-Phe(N05) (31,0 г) растворяют в диметилформамиде (150 мл), после 45 чего добавляют к полученному раствору 1-окси-бензотриазол (27,0 г), охлаждают смесь до -5°С и затем добавляют к ней дициклогексилмочевину (20,6 г). Смесь выдерживают в течеполучают 21,16 г (81,6% от теорети- . - - „;Г-5°С, в т ни коточеского выхода) - «--:;°/;; Га;о- РЬ-х к нГй добавляют раствор Рго-ОМе, тида. По данным тонкослойной хромато f , .,

графии (2,7,8), полученный продукт не содержит примесей.

BOC-Tyr.D-Met.Gly (4).

f 4 Л Л сс

Л. J л. i « 1-« - /л-хЗащищенный трипептид (3) (21,1 г) растворяют в смеси метанола (350 мл) и воды (150 мл) М проводят омыление путем обработки 2 М раствором NaOH (55 мл). Протекание реакции контре1и1Л л лсгг j,jv cijj i «t

HCl (16,55 г) и N-метилморфолина (10,1 г) в диметилформамиде (30 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 ч при 5 С и затем отфильтро вывают от дициклогексилмочевины. После упаривания в вакууме получают маслянистую жидкость, которую раство ряют в этилацетате (1500 мл) и про

15

еЭУ

лируют с помощью тонкослойной хроматографии (7). Установлено, что реакция заканчивается через 45 мин. Пос ле окончания реакции метанол отгоняют в вакууме, водный раствор охлаж- .дают льдом и нейтрализуют 1 М раствором НС1 (110 мл). Выпадающий в осадок продукт отфильтровывают, промывают несколько раз водой и высушивают над Ра05. Выход: 20,18 г (98% от теоретич.). Результаты тонкослойной хроматографии: одно пятно в 2,7,8.

Рассчитано,%: С 53,73; Н 6,6Г, N 8,96.

CiiH3,NjO-,S

Найдено,%: G 53,55; Н 6,62, N 8,76.

BOC-Tyr.D-Met(O). Gly (5). Раствор BOC-Tyr.D-Met.Gly ( 5,48) 20 в метаноле (120 мл) обрабатывают

двумя эквивалентами перекиси водорода (2,7 мл 29,4%-ного раствора). Протекание реакции контролируют с помощью высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии. После выдержки смеси в течение 20 ч при комнатной температуре ее упаривают досуха и растирают остаток с эфиром. Вы- xo;f: 5,46 г (96,5% от теоретического). Т.пл. 186-188°С (с разложением).

25

30

г -,5.5

формамид).

.

1,0° (, диметил- 1,3 (С 1, диметилформамид).,

Рассчитано,%: С 51,96, Н 6,39, N 8,66.

С ,,Н 5,Ы50„3

Найдено, %: С 52,13, Н 6,38;

N 8,53.

BOC-Phe(NO,2) .Рго.ОМе (в).

BOC-Phe(N05) (31,0 г) растворяют в диметилформамиде (150 мл), после чего добавляют к полученному раствору 1-окси-бензотриазол (27,0 г), охлаждают смесь до -5°С и затем добавляют к ней дициклогексилмочевину (20,6 г). Смесь выдерживают в тече - - „;Г-5°С, в т ни котоРЬ-х к нГй добавляют раствор Рго-ОМе, f , .,

1и1Л л лсгг j,jv cijj i «t

HCl (16,55 г) и N-метилморфолина (10,1 г) в диметилформамиде (30 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 ч при 5 С и затем отфильтровывают от дициклогексилмочевины. После упаривания в вакууме получают маслянистую жидкость, которую растворяют в этилацетате (1500 мл) и про

ьшaют 5%-ным раствором лимонной кислоты ( мл), 5%-ным раствором NaHCOj (2х250 мл) и полунасыщенным раствором NaCl (2250 мл). Органическую фазу высушивают и концентрируют до 500 мл. Выпадающий осадок дициклогексилмочевины отфильтровыва- JOT, а фильтрат упаривалт, получая в результате смолу, которую не идентифицируют .

H.Phe (N0.2). Pro.OMe.HCl (7), Защищенньй дипептид (21,41 г) / растворяют в этилацетате (300 мл) и охлаждают полученный раствор до , после чего пропускают .через него сухой газообразный хлористый водород в течение 45 мин, поддерживая температуру 0°С, Затем раствор концентрируют до 50 мл и разбавляют сухим эфиром (300 мл). После вымораживания продукт отфильтровывают, тщательно промывают сухим эфиром и высушивакуг над смесью Р205 и NaOH.

Выход: 15,64 г (85% от теоретич.) Т.пл. 145-148 с.

- 15,7 (, МеОН)

J-r Lcljf 17,6° (, МеОН),

Рассчитано,%: С 50,35; Н 5,59, 11,75.

BOC-Tyr.D.Met (0).Gly.Phe (N0). .ProNH-2 (0,81 r) суспендируют в анизоле (14 мл) и обрабатывают суспензию одномолярной смесью НС1 и уксусной кислоты (80 мл). После выдержки реакционной смеси в течение 45 мин при комнатной температуре ее упаривают досуха и остаток растирают с

35

CijH.NjOsCl

Найдено,%: С 50,03, Н 5,81, N 11,45.

BOC-Tyr.D-Met (0). Gly.Phe (NO.) .Pro.OMe (8)«

Раствор BOC-Tyr.D-Met(O). Gly (1,0 r) в диметилформамиде (30 мл) охАавдают до -5-С, после чего обраба-40 Полученный продукт подверга- тывают его 1-оксибензотриазолом к,т очистке с помощью ионообменной

хроматографии на колонке 2, см, заполненной карбоксиметилцеллюлозой. Элюирование осуществляют при Лг1ней- ном градиенте 0,,2 М ацетата аммония при рН 5,1. Выход: 0,33 г. По данным тонкослойной и высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии, полученный продукт не со45

(0,56 г.) и дициклогексилкарбодиими- дом (0,42 г). Смесь перемешивают в течение 40 мин при , затем добавляют к ней раствор Phe (NO/|).Pro .OMe.HCl (0,74j и N- метилморфолина (0,21 г) в диметилформамиде (5 мл) и проводят реакцию сочетания при 5°С в течение 20 ч. Выпадающий осадок дициклогексилмочевины отфильтро- держит примесей, вывают, а фильтрат концентрируют в вакууне. Сырой продукт распределяют между этипацетатом (100 мл) и водой (20 мл). Органический слой промывают 5%-ным раствором лимонной кислоты ( мл), 5%-нь1М раствором NaHCO ( мл) и водой ( мл), высушивают над безводным MgSO, и упаривают, получая в результате аморфный

Рассчитано,%: С 51,15; Н 6,00, N 13,05.

СзоН„Ы70 -СН5СО.

Найдено,%: С 50,83; Н 6,06 N 12,91,

Rf 0,53-, 0,13

MD- 6,3 (,2). Rf 0,32, 0,65 0,64.

10

) 25

4701998

твердый остаток, который после растирания с эфиром весит 1,0 г (62% от теоретич. выхода). По данным тонкослойной хроматографии (2), в полученном продукте присутствует некоторое количество дициклогексилмочевины. дальнейщую очистку не проводят, , BOC-Tyr.D-Met(O).Gly.Phe (N0). .Pro-NH, (9).

Полностью защищенный пентапептид (1,0 г) растворяют в метаноле (150 мл), раствор охлаждают в смеси льда с солью и насыщают аммиаком. 5 После этого колбу закрывают и оставляют смесь в течение 6 дней при комнатной температуре. Затем после тщательного удаления аммиака и метанола образующийся продукт экстрагируют смесью этилацетата и зфира. Выход: 0,81. г (83% от теоретич.). По данным тонкослойной хроматографии (2,7,8), полученный продукт содержит некоторое количество дициклогексилмочевины и небольшое количество исходного материала. Полученньй продукт используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

20

H.Tyr.D-Met (0).Gly.Phe (N0). .PrONH,, (10).

BOC-Tyr.D.Met (0).Gly.Phe (N0). .ProNH-2 (0,81 r) суспендируют в анизоле (14 мл) и обрабатывают суспензию одномолярной смесью НС1 и уксусной кислоты (80 мл). После выдержки реакционной смеси в течение 45 мин при комнатной температуре ее упаривают досуха и остаток растирают с

Полученный продукт подверга- к,т очистке с помощью ионообменной

держит примесей,

Рассчитано,%: С 51,15; Н 6,00, N 13,05.

СзоН„Ы70 -СН5СО.

Найдено,%: С 50,83; Н 6,06 N 12,91,

Rf 0,53-, 0,13

MD- 6,3 (,2). Rf 0,32, 0,65 0,64.

Пример 2 (см. схема 2). BOC-Phe (N0j).Pro.NH7(11). BOC-Phe (NOa).Pro.ОМе (6) (22,9 г растворя1гт в метаноле (250 мл) и охлаждают полученный раствор льдом, после чего пропускают через него га- зообразный аммиак до насьпцения. Затем колбу закрывают и оставляют при комнатной температуре в течение 7 дней. После этого реакционную сме упаривают в вакууме и сырой продукт подвергают кристаллизации из этил- ацетата. По данным тонкослойной и высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии, полученный раствор не содержит примесей. Т,пл. 176-178,5°С.

UlV - 29,4° (, ). ,- 35,7 (, МеОН). Рассчитано,%: С 56,16, Н 6,40, N 13,79.

C,,H jN4vJt.

Найдена,%: С 55,60, Н 6,33,

N 14,04., .

H.Phe (NO,).Pro (12) BOC-Phe (N0). Pro.NH-2 (8,0 г) растворяют в смеси метанола (20 мл) изопропанола (40 мл) и этилацетат (375 мл). Полученный раствор охлаждают льдом и пропускают через него в течение часа газообразный НС1 no держивая температуру-15 С.

После этого через реакционную смесь в течение 5 мин пропускают азот и разбавляют ее сухим эфиром

Схема 2

Pro

ОМе

/5

(450 мл). Образующийся продукт от- фильтровывают, тщательно промывают эфиром и высушивают в вакууме над смесью и NaOH. Выход 6,28 г (93% от -теоретич.). Т.пл. 156-15J О.

13,5 15,3

(, МеОН). (, МеОН).

5

0

JQ jj

5

BOC-Tyr.D-Met.Gly.Phe (NO).Pro. .NH-2 (13).

BOC-Tyr.D-Met (0).Gly (5) (1,0 г) растворяют в диметилформамиде (20мл) и охлаждают полученный раствор до -25°С, после чего к нему добавляют N-метилморфолин (0,21 г) и изобутил- хлорформиат (0,28 г) и интенсивно перемешивают смесь в течение 2 мин, поддерживая ее температуру равной -15°С. Затем к ней добавляют предварительно охлажденный до -25°С раствор Phe (NO-2).Pro.NHa.HCl (0,71 г) и N-метилморфолина (0,33 г) и перемешивают при -15 С в течение 2,5 ч. После этого реакционную смесь переносят в ледяную баню и обрабатывают 2М КНСОз (2,5 мл) в течение 30 мин. Растворители отгоняют в вакууме,, а остаток распределяют между этилаце- татом (270 мл) и водой (40 мл). Органическую фазу отделяют и промывают 5%-ным раствором лимонной кислоты ( мл), 5%-ным раствором NaHCOj (240 мл) и водой (2x40 мл). Экстракт высушивают и упаривают досуха. Носле растирания остатка с эфиром получают 0,56 г продукта (35% от теоре- тич. выхода). Полученный продукт используют на следующей стадии без дополнительно й очистки.

H.Tyr.D-Met (O).Gly.Phe (N0).Pro

.NHjCU),

От BOC-Tyr.D-Met(O).Gly.Phe (NOj)

..Pro.NHa (0,56 r) отщепляют защитную группу в молярной смеси НС1 и уксусной кислоты (56 мл) в присутствии анизола (20 мл). После выдержки в течение 30 мин при температуре окружающей среды реагенты удаляют в вакууме и полученный сырой продукт путем растирания остатков с эфиром, Полученный сырой продукт подвергают хроматографии на колонке 2,5 25 см, заполненной карбоксиметилцеллюлозой. Элюирование осуществляют при линейном градиенте 0,005-0,2 М ацетата аммония при рН 5,1, После такой предварительной очистки пептид снова возвращают в колонку 2, см, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и осуществляют элюирование ацетатом аммония с линейно изменяющейся концентрацией от 0,005 до 0,1 М при рН 5,1. После, удаления летучего буфера с помощью проводимой несколько ра сублимационной сушки получают чистый пептид. Выход: 50 мг (91% от теоре- тич,). По данным тонкослойной (2,7,8 ;и высокоскоростной колоночной жидкостной хроматографии,, полученный продукт не содержит примесей.

Рассчитано,%: С 50,52, Н 6,05,; N 12,89.

СзсНэзМ ОэЗ-СНдСОгН 1,5 Найдено,%: С 50,59; Н 5,96;

N 12,97.

Пример 3. H-Tyr-DMet Gly- Phe(4NO Profflii получают согласно схеме, указанной выше. Продукт выделяют в виде хлористоЕюдородной соли присоединениял а затем чистят на карбоксиметилцеллюлозе (CMC 52) градиентным элюированием буферньгми растворами уксуснокислого аммония (0,001-М до 0,5 М), После лиофилиза ции из водного раствора получают уксуснокислую соль присоединения

Rf: 0,52, 0,83 0„47«

. «8,1, (,2 МеОН).

Фармакологическая актибность.

Пептиды указанных примеров испы- тывагш на следующие виды активности

5

0

5

0

с помощью стандартных фармакологических способов.

Анальгезия в мышах при испытании горячей пластиной, причем пептид вводят посредством инъекции внутрь мозгового желудочка.

Антидиарейная активность в крысах. В этом способе крысы голодают в течение 24 ч, затем пептид вводят подкожно или орально, после чего через 15 мин дают орально касторовое масло по 1 мл на крысу (EDjo - 0,02- 0,03 мг/кг).

Для протйвокашлевого испытания, морских свинок подвергли воздействию аэрозоля, содержащего 20% лимонной кислоты, через 30 мин после введения соединения (орально или подкожно). Подсчитывали число кашлей в течение пятиминутной экспозиции и усредняли значения для шести животных в опыте (EDjo -10 мг/кг P.O.). .

Анальгезия в мышах в испытании с судорогой (модификация спо соба Гендерсона с сотр.) при оральном введении пептида.

Основное их назначение - лечение диареи.

При испытании на крысах для син- ,тезированных пептидов и морфина были получены следующие значения EDjo (см. таблицу)5 характеризующие их анальгетическую активность.

Испытываемые пепти,цы малотоксичны - при введении их по отдельности перорально пяти мышам в количестве 500 мг/кг ни одна из мьшей не умерла.

Соединения по изобретению малотоксичны, обладают высокой противо- диарейной, анальгетической и проти- вокашлевой активностью.

Формула изобрете.ния Способ получения пептидов формулы

H-Tyr-X-Gly-Phe(4NO)Pro-NH, где X-DMet, DMet(O),

131470199

или их кислотно-аддитивных солей, яе Y NH20Me,

отличающийся тем, что « получаемый при этом пентапептид трипептид формулыформулы

BOC-Tyr-X-Gly-Phe(4N05)-ProY,

BOC-Tyr-X-GlyOH,5 g случае необходимости, если Y-OMe,

где X-DMet или DMet(O) обработке аммиаком заменяют ОМе

подвергают взаимодействию с дипепти- .группу на аминогруппу, затем отщеп- дом формулы «« защитную группу и целевой

IQ продукт выделяют в свободном виде H-Phe(4NO.j)ProY,ипц g виде кислотно-аддитивной соля.