Способ получения пептидов, содержащих сульфат тирозина Советский патент 1982 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61K38/10 C07K1/06 

ние за цищенного дипептида с {-/--декапе.пгмдом. содержащим сульфат тирозина. Введение остатка серной кислоты D тирозине в незащищеи1 ый октапептид происходит посредством .концентрированной серной кислоты, причем вследствие образования большого количества побочных продуктов, выход после, очистки 20% до - 25 Таким же способом получают ряд аналогов PZ-октапептида, из которых ге в которых N-конечная аспарагиновая кислота за - енена другими аминокислотными остат нами, малеиновой и фурмаровой кисло/raMi-iJ являются также биологически высокоактивными,

Получаемые при использовании центрированной сарной кислоты сульфонированные по ароматическому кольцу тирозина в положении ЗР2-окта-, дека- 20 И додекапептиды, показывают высокую биологическую активность. Други( побочные продукты при полу чении С-конечных последовательностей PZ являются исходными продуктами, т.е. идентичный несульфатированный ряд, который может быть поручен такж отщеплением .при переработке вследствие кратковременной кислой реакции, ..производные с замещением у кольца триптофана, которые могут об разоваться во время ступенчатого син теза при повторяющихся отщеплениях защитных групп-Вое посредством трифторуксусной кислоты. Полученный в процессе синтеза простейший-PZ-nen тид высокой биологической активности является Boc-Tyr(SO j-} Met-Gl3/-Trp-Met-Asp-PheNlIj Остаток серной кислоты вводят в Бос-гептапептид на последней стадии . Для большинства активных пептидных веществ удаление N-конечной аминогруппы усиливает био логическую активность,и что введение N-конечных ацильных групп, кроме того, препятствия расщеплению посредством аминопептидаз, является выгодным для биологической активности. Целью изобретения является получение кратчайшим путем Бос-Туг(50Г)-№t-Gly-Tip-r.fet-Asi:)-P ieMi2 с высоким процентом выхода, избегая неэкономичную операцию очистки, исходя из промышленного продукта Trp-Met Asp-PIieMi использование его в качеств исходного продукта для получения сле дующих, в особенности Л-ацилированны РЕ-пептидов и, исходя из этого, полу

чение действующих на желчный пузырь PZ-пептидов по, возможности с простой структурой.

Поставленная цель достигается тем,

что этерифицированный серной кислотой по тирозину Защищенный пептид, содержащий 2-6 остатков аминокислоты, используют в качестве промежуточного продукта.

Способ получения X-TyrfSOjJ-Met-Gly-Tn -Met-AsD-PhcMl, где-.Х HsO OOC-CHi -СН., -СО ;HO-Cg, СО ; HOOC--CH,,Qig.CO, и другие ацильные остатки заключается в том, что заи;и

щенный трип.ептидный эфир Y-Tyr MetGly-0-алкил сульфируют, алкилэфирную группу отщепляют омылением, защищенный сульфированный трипептид конденсируют с Tr{:i rvfet-Asp-PheMl2, преимущественно методом смешанных ангидридов, и .полученный после отщепления защитной.группы гептапептид ацилируют. при добавлении с.лабой органической щелочи, преимущественно Nэтилморфолина. При переработке продукта после сульфирования используют воднощелоч- ной буферный, раствор, преимущественно . Для выделения защитного трипептида используют смеси высших спиртов с уксуснокислым эфиром, преимущественно н-бутанолэтилацетат. В качестве защитной группы используют третичный бутилоксикарбонил и ее отщепление от гeптaпeпtидa осуществляют трифторуксусной кислотой при добавлении в избытке метоксибензолмеркаптоэтанола при комнатной температуре. Получаемые при кислотной обработке фракции десуфатированного пептида такой же аминокислотной последовательности отделяют после ацилирования ам.иногрупп. Существует способ, используемый для синтеза высших тирозинсульфатпептидов на примере нескольких N-аци-. лированных С-конечных гептапептидов панкреоцимина (PZ}. X-Tyr(OS05)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNHгде:X HOOG-aLСН СО; H.G - СН OGO-GH.r -ГЛг-СО -, У-НО-СаНц-СН СО. В предлагаемом способе защищенный пептидный фрагмент, который может

5 9200536

состоять из 2-6 остатков аминокисло-образовании побочных продуктов посты и содержать остаток тирозина, этерифицируется посредством воздействия избытка комплекса пиридин-SOj или

смесь из пиридина, хлорсерной кислоты 5для отщепления бутилоксикарбонильной

в диметилформамид/хлороформе и сер-защитной группы установлено использоной кислоты. При сульфатированиивание трифторуксусной кисBoc-Tyr-Met-Gly-OAt 30-кратным избыт-лоты в присутствии -избытка меркаптоком Cl-SOjH в смеси достигается 100%этанола и метоксибензола. При этом

превращения. Рас1депление связи эфир- Юполностью исключаются побочные реаксерная кислота из-за кратковременной кислой реакции при обработке реакционной смеси предотвращается помещением в щелочную буферную систему. например NHj/Mli,Cl. Продукт реакции 15 может быть легко извлечен из буферНОИ смеси смесью высших спиртов, например л-бутанолом или эфиром уксусной кислоты с выходом 70. преимущество способа заключается в том, что могут быть использованы также и загрязненные продуктами О- ацилтирозина производные защищенного тирозина, например NO-Di-Boc-Tyr очистка которых обходится очень дорого. При обработке выделением полу ченный 0-ацилтирозиновый пептид коли чественно удаляется из тирозинсульфатного пептида. Бос-Туг(SOp-Met-Gly-OXt посредством щелочного омыления переводится известным образом в трипептидную кислоту и выделяется посредством н-бутанол/уксусного эфира (выход 75%) N-защищенная пептидная кислота, содержащая сульфат тирозина, может быть обычным методом сконденсирована в пептид со свободной -аминогруппой. Для связывания Бос-Туг(S0)-Mst Gly с Тгр-Ме1-Л5р-РЬеМ12.используется преимущественно синтез смешанных ангидридов (88% выхода)..Получение Вос-защищенного С-конечного панкреоцимингептапептида Бос-Туг(50)-MetGly-Trp-Met-Asp-Phe№-I происходит таким способом с более высоким общим выходом и более высокой частотой, чем известными способами синтеза, в которых сульфатирование предпринимается как последняя стадия реакции. За счет предложенного способа обе печивается полное расщепление азотно защитной группы при одновременном минимальном кислотном гидролизе связи эфир-серная кислота, т.е. при мин мальном отщеплении остатка 80 от гидрокислотной группы тирозина, а также при одновременном минимальном

редством циклического защемления у остатка триптофана..

В качестве благоприятного условия

ции на триптофане. Гидролиз эфира серной кислоты остается ниже 20. Очень выгодным является использование бутилоксикарбонильной защитной группы по сравнению с известными защитными груп,пами, которые могут отщепляться в слабокислой, нейтральной или щелочной средах. , Получаемый идентичный в последоВательности пептид со свободной гидроксильной группой на тиразоле очень легко отделяется последующим азотным ацилированием, если это необходимо для предусмотренной цели использования. Ацилирование полученного таким способом С-конечного панкреоцимингептапептида 1)1 (050)-Met-Gly-Trp Met-Asp-PheNIi;j. осуществляют реакцией с активированными эфирами соответствующих карбоновых кислот, например с эфиром 2,,5-трихлорфенил-П-гидроксифенил-уксусной и этиловым эфиром янтарной кислот или с ангидридом янтарной кислоты. Для этого гепапептид освобождают от трифторацетата слабым органическим оснойанием, преимущественно М-этилморфо, ,, , . лином ( . Ацилирование проводят при добавлении N/Vt, Ион переработке остается на сульфиров анных гептапептидах. Из полученных таким образом aцил-PZ-гeптaпeптидoвсукцинил-PZ-гeптaпeптид, обозначаемый еще как дезамино-р7.-октапептид, (X НООС-Шг СНг-СО) показывает высокую активность при воздействии на желчный пузырь, которая почти равносильна активности церулеина. Производные П-гидроксифенилацетила и этоксисукцйнила достигают только 1% активности иГерулеина. Отделение десульфатирова.нных побочных продуктов, может осуществляться противоточным разделением посредством хромотографии на декстрановом геле- Так как молекулярные вес; са обоих соединений различаются нез-i. начительно, эффект разделения поразителен. П р я м ер 1, Аммонийная соль Н-трет6ути.поксикарбйнол о-сульфаттирозмл-Ь-метионил-глицин-этиловогоэфира. 2j8 г 0,03б моль) пиридина в 10 мл хлороформа охлаждают до -10 С. При перемешивании мин в этот раствор -добавляют по каплям 2,1 мл 0,037 моль) хлорсерной кислоты при чем следует поддерживать температуру 4-1 . По окончании добавления реакционную массу перемешивают еще 30 мин при С, и добавлением затем 10 мл дилатилформамида смесь комлекса пиридин--80з и пиридингидрохлорида переводят в раствор. 0,600 г (1,21 моль) Boc-Tyr-tet-Gly-OAt, растворяют в 10 мл диметилформамида и 10 мл пиридина и при перемешивании добавляют к раствору комплекса пиридин 30з . Затем 5 ч смесь перемешивают, грея на водяной бане при +35 С растворитель удаляют в вакууме с помощью масляного насоса прм , и масля)-(истый остаток при (-5)0°С при сильном перемешивании очень быст ро смешивают с 200 мл 0,1 N-NH,, С1/ /0,1N-MIj буферного раствора (рН10,5 Затем значение рН этим буферным раст вором быстро устанавливают на 7,0. Выпавшее в осадок из водной фазы твердое вещество переводят в раствор добавлением 70 мл смеси н-бутанол/ /уксусный эфир (2:1). Водную фазу отделяют, насыщают NaCl и трехкратно экстрагируют 70 мл указанной смеси. Органические экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором NaCl до тех пор, пока не исчезнут ионь SOjj и органическую фазу сушат над . Раствор упаривают на половину. Раствор, содержащий н-бутанол отделения Вос-ТугГВос -Met-Gly-OAt медленно при перемешивании вливают в 2,5 кратное количество холодного эфира. Выпавший в осадок продукт отсасывают, тщател но промывают эфиром и петролейным эфиром и сушат в вакууме над .i. Выход;0,50 г (). Т.пл. 139-1 1°С Wyr (-9,8)(C-1,0 в диметилформамиде) .Аминокислотный анализ после щелочнрго гидролиза: ТугЗОч 0,87; Туг 0,05; Met 0,89; Gly 1,0. Чистоту продукта проверяют тонкослойной хроматографией на cилyфoлoвы пластинках фирмы Кавалер ЧССР в системе (А)ВиОН (ледяная уксусная кислота/вода (4:1:1) и (В) пиридин/ /и бутанол/ледяная уксусная кислота/вода (20:30:6:24). 0,66 ; 0,, Пример 2 . Натриевая соль V-третбутилоксикарбойил-О-сульфатЬ тирозил-Ь-метионил-глицин. 0,5рО г (0,84 оль) Вос-Туг(SO,Mi||)-Met-Gly-OAt растворяют в 5 мл смеси вода - этанол в соот ношении 1:1 и при комнатной температуре , f5 мин перемешивают с 3 мл 1 н. NaOH. Раствор упаривают в ротационном с-спарителе при +40°С до половины его объема и оатем разбавляют - 5 мл воды. Устанавливают 1 н. НС1 при рН раствора 3,0. Водную фазу экстрагируют 50 мл смеси н-бутанол/уксусный эфир (2:1), затем насыщают NaCl и тщательно взбалтывают с двумя порциями указанной смеси растворителя до 50 мл каждая. Органические фазы объединяют, промывают насыщенным раствором NaCl и сушат над Naj,SOi. Растворитель удаляют в вакууме при +kO°C, остаток сушат многократ IM выпариванием при добавлении хлороформа. Стекловидный остаток расти- - - -рают со смесью эфир - петролейный эфир,твердое вещество тщательно промывают эфиром и петролейным эфиром и высушивают в вакууме над РцО|0- Выход; 0,360 г (75); т.пл. ige-igS c. k,p 6,8 (С-0,5 в диметилформамиде) ,д 0,64; R 0,57. Пример 3- Натриевая соль N-третбутилоксикарбонил-О-сульфат-L-тиpoзил-L-мeтиoнил-глицин-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланимамида. 0,360 г (0,631 -моль) Вос-Туг(SO 3 Na)-Met Gly-OH растворяют в 20 мл диметилформамида, добавляют 0,079 мл (0,631 .моль) N-этилфорфолина и .реакционный раствор охлаждают до -25°С. Добавляют к нему 0,086 мл (0,631 моль) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты и затем выдерживают для активирования 10 мин при -25°С. 0,00 г (0,631 моль) Тгр-Met-Asp PheN i2,pacтвopяют отдельно в 20 мл диметилфор/иамида, смешивают с 0,079 мл (0,631 моль) N-этилморфолина и реакционный раствор охлаждают до . Полученную смесь добав ляют к раствору смешанного ангиддид Бос-Туг SOjNai-Met-Gly-OH. Затем смесь перемешивают 30 мин при и 4 ч при комнатной температуре. Вы павший в осадок амингидрохлорид отсасывают, растворитель удаляют в вакууме с помощью масляного насоса и вязкотекучий остаток растирают на холоде со смесью н-бутанол - эфир (1:1) . Твердое вещество отсасывают, тщательно промывают хлороформом и высушивают в вакууме над Р/,0,5,. выход: 0,650 г (881).- Т.пл. iS t186°С. tcClp Г-7,1)(,25 в диметилформамиде) 14Ло 3,7 (,25 в ) Аминокислотный |анализ после щелочно го гидролиза: TyrSOA,0,88; Туг 0,0 Phe 0,9; Asp 1,0. Rf 0,64; Rp 0,67. Пример k. О-сульфат-Ь-тиро зил-Ь-метионил-глицин-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланиамид-трифторацетат. 0,650 г (56 мoль) Бос-Туг(SaNa vfet-Gly-Trp-f.fet-Asii-PheNH j смешивают с 0,5 мл метоксибензола и 0,1 мл 1-меркаптоэтанола и затем 20 мин перемешивают с 125 мл трифт уксусной кислоты при 18-20 С. Реакционный раствор добавляют в двукрат ное количество смеси эфир - петроле ный эфир (1:1) и отсасывают от рыхлого осадка. Тщательно промывают ос док петролейным эфиром и высушивают в вакууме над РцО,о/КОН. Выход:0,550 (85). Rf. 0,32 и 0,62 (около 20°); Щ 0,57 и 0,77 (около 20°) Аминокислотный анализ после щелочного гидролиза: (305Н) 0,68; Туг 0,23; Asp 0,74; Gly 1,0; Met 1,6; Phe 0,9; Trp 1,1. Пример 5. N-сукциноил-О- сульфат 1,-тирозил-Ь-метионил-глицин-L-трип ТОФИЛ-L-мет ион и Л-L-a cna pтил-Ь-фенилаланинамид. 0,550 г (0, моль) продукта полученного в примере k, растворяют в 10 мл диметилформамида, при перемешивании смешивают с 181 мл (0, -моль) N-этилморфолина (никакое другое основание не применять) и охлаждают реакционный раствор .до . Затем в течение tO мин добавляют при перемешивании 0,062 г 0,00062 1 .моль) янтарного ангидрида и одновременно добавляют по каплям 0,079 мл N-этилморфолина, Реакционный раствор перемешивают еще в течение 3 ч и оставляют на но.мь при +Ц°С. Растворитель удаляют в вакууме на масляном насосе при +kOC., и вязкий остаток растирают с холодной смесью н-бутанол - эфир, твердое вещество отсасывают, тщательно промывают тетрахлорметаном, эфиром и петролейным эфиром и высушивают в вакууме над Pj, Ощ. Выход: 0,588 г (91%). Т.пл, 172-175°С. Аминокислотный анализ после щелочного гидролиза: ТугЗОц 0,72, Тут 0,18; Asp 1,0; Gly 1,1; Met 1,6; Phe 0,93; Тг-р 0,75; Rf. 0,53 и 0,70 (); Lp .. 064; и 0,68. (- 20%). Очистка гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Набухший в течение нескольких часов сефадекс G-25 в 0,1 н.растворе ацетата аммония (прибавлением аммиака к 1н. уксусной кислоте до рН 6,5) вводят в колонку длиной 120 см и диаметром k см. Загружают раствор 200 мг неочищенного дезаминоктапептида в 8 мл О,1 н. раствора ацетата аммония и 2 мл диметилформамида и элюируют 0,1 н. раствором ацетата аммония. При скорости прохождения 15 мл/ч определяют концентрацию пептида измерением экстинкции при 280 им (Uvicord), элюат собирают фракциями по 8 мл. Фрации содёржат дeзaминo-PZ-oктaпeптид, фракции 323 - десульфатированный побочный продукт. Выход 0,116 г (60) и 0,055 г () десульфатированного гептапептида М 3, ± 0, 0,25 в воде tcL 9,А ± 0,25 в диметилформамидеАминокислотный анализ после щелочного гидролиза ( Tyr(OSOn Тут Asp Gly Met Phe Trp 0,80 0,08 1,0 1,0 1,64 0,90 1,8 Пример 6. N-этоксисукцинил-0-сульфат-L-тирозил-Ь-метионил-глицин-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспар-. тил-Ьфенилаланин-амид. 0,190 г (0,167 ;моль) Tyr(6sOj)- fet-Gly-Tтp- fet-Asp-Phe Шг. (пример ) растворяют в 10 мл диметил- . формамида и добавляют 0,0182 мл (О , Й6 -1моль) N-этилморфолина. Реакционную смесь охлаждают до Ос и

лсбаоляют 0.059 г (0,182 ;- Моль} эфира 2 . , 5 трихлорфеиил--этоксиянтарно кис,/|от:1, иереА-.ещцЕзают 30 мин при О и остаз,пяют на 2 дня при комнатной ,уре. Растворитель удаляют в вакууме при , маслянистый остаток днгерируют эфиром/петролейным эфиром, твердое вещество отсасывают и промьшсзьот хлороформом, эфиром и петролейным эфиром. Выход: 0, г ,(751) ; Rfp, - 0,61 12 в; Rf 0,705 с десульфатированного, ацилированного гептапептида,

Очистка разделением противотоком

В качестве разделительной систем используют хлороформ/метанол/о,1 н, ацетат аммония (11,1:8:10). После 32 разделительных стадий и лиофилизации выход продукта составляет 8-t% (фракции 24-31) наряду с 153 десульфированного, ацилированного гептапетида (фракции 20-22}-Кислотно-щелочное титрование и определе: ние сульфата (ВаЗО) дают 90% или вычислительных значений.

Пример 7- п-гидроксифенилацетил 0-сульфат-Ь-тирозил-Ь-метионил-Ь-триптофил-Ь-метилнил-Ь-аспартил-L-фенилаланинамид.

0,190 г (0,167 моль) сульфата гептапептида (по примеру ) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют 0,0182 мл 0,1)6 ,моль) М--этилморфолина и реакционную смесь охлаждают до . Добавляют 5б мг (0,182 1моль) эфира 2 ,( ,5 трихлорфенил-п.-гидроксифенилуксусной кислоты, перемешивают 30 мин при О С и два дня при комнатной температуре. Растворитель удаляют в вакууме при +45°С, и маслянистый-остаток дигерируют эфиром/петролейным эфиром (1:1). Твердое вещество отсасывают и промывают хлороформом, эфиром петролейным эфиром. Выход: 0,150 г (80); Rpb 0,59 при R 0,69- десульфированного, ацилированного гептапептида. Очистку проводят методом противоточного/разделения. Выход (фракции 24-31) наряду с 15 десульфированного гептапептида (фракции 11-23). Кислотно-щелочное титрование и определение сульфата (BaSO) дают 95% или 93 вычисленных значений: „

Ьос-Туг -Met -Сгу -OAt

0, комплекс пиридин-ЗОг

Boc-Tur-CSOj-Nl-Ll-Mjt-GPyOAtffS 5,,t4DH

(SD3-Na)-Met-&2y-OH(2)- Trp-Met-.5р-PheMHj 80

Гинтез метЪдом смешанных ...ангидридов

bDC TyrCSOsN5)-MEt -Щ -Тгр-Ме -Scip-PheWH (5) -в5%

. 51 TFE/Cg HsOPHj/HSA.T Tyr(S03)M8t-G y-Tpp - Met -Xsp-PHeNHsL TFE

(Ч) .-CO ,

С Иг- со

Q07oсесрадекс .

tli% Туг Met- fiBi/ -Trp -Asp -PheMHa (5)

Ho6c-DH --eHj -co-Tyr(so;)-Met-Gey

-Met-/ sp -PheWHi 75% -CO-HHi-CO-D-CfiHj.Cei H5CtO-CO-CH2.-CHa CO-Tyr(SDg)-Het Щ Trp-Met AspPheNH a (6)

so% -HO-CsHM-CHa-CO-O-CbHaCtib HO-Cs -Нч-СНг-СО-Т4г(50з)-Ме1-&еу Тгр -Met- sp-pheMH2 « ( 1 .

формула изобретения

1,Способ,получения пептидов,содержащих сульфат тирозина 6-20 остатков аминокислоты с этерифицированным серной кислотой тирозином,путем сульфирования защищенного пептидного остатка, содержащего тирозин, конденсации его

обычными методами пептидной химии с аминогруппой другого пептида, содержащего 2-14 остатков аминокислоты, и последующего замещения по .J -аминогруппе после отщепления защитной группы, отличающийся тем, что этерифицированный серной кислотой по тирозину N-защищенный пептид содержащий 2-6 остатков аминокислоты, используют в качестве промежуточного продукта.

2,Способ получения Х-Т7г(50)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe//H, где:

X %о,оос-снг-снг-со-, HO-CgHgai -cq

HOOC-HCp-QIc-CO и другие ацильные

. с.J

остатки по п,1, отличающий с я тем, что защищенный трипептидный эфир Y-TyT-Met-Gly-0-алкил сульфируют, алкилэфирную группу отщепляют омылением, защищенный сульфированный трипептид конденсируют с Trp-Met-Asp-PheMlg преимущественно методом смешанных ангидридов, и полученный после отщепления защитной группы гептапептид ацилируют при добавлении слабой органической щелочи, преимущественно М-этилморф.олина.

1

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и Мающийся тем, что при переработке продукта после сульфирования используют воднощелочной буферный раствор, преимущественно- NH5/NH(,C1.

k. Способ по п.2, от л и ч а ю щ и и с я тем, что для выделения защитного сульфированного трипептида используют смеси высших спиртов с

уксуснокислым эфиром, преимущественно Н-бутанолэтилацетат.

5. Способ -по П.2, о J ли чающий с я тем, что, в качестве |щитной группы используют TpetH4HbiH бутилоксикарбонил и ее отщепление JOT сульфированного гептапептида осуществляют 75-85%-ной трифторуксусной кислотой при добавлении и избытке метоксибензолмеркаптоэтанола при комнатной температуре.

6. Способ по ПП.1, 2 и 5 о т .лГй чающийся тем, что получаемые при кислотной.обработке фракции де- сульфатированного пептида такой же аминокислотной послёдовательности. отделяют после ацилирования аминогруппы.