Гексапептид, обладающий гепатопротективным действием Советский патент 1989 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к новому биологически активному соединению - гексапептиду:

Phe-Ala--Gly-Phe-Gly-Arg,

обладающему гепатопротективным действием, которое может найти применение в медицине.

Цель изобретения - поиск п области биологически активных соединений пептидной природы, обладающих высокой гепатопротективной активностью и не имеющих побочных свойств.

Синтез предлагаемого гексапептида проводят следующим образом.

Карбобензокси-глицил-аргинин (I). К суспензии 1,58 г (9,07 ммоль) аргинина в 25 мл диметилформамида добавляют 3,30 г (9,98 мм) п-нитрофенилового эфира карбобензокси-глицина. Смесь размешивают при комнатной температуре в течение суток. Диметил- формамид отгоняют, остаток растворяют в 5 мл метанола и добавляют 300 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровы- ,вают, промывают на фильтре эфиром, cyniaT в вакуум-зксикаторе.

Выход продукта 3,09 г (93%), Т.Ш1. 135-135,5.. .

(ot) +10,3 (с 1, ДМФА).

Ri 0,25 (н-бутанол:уксусная кис- лота:вода 3:1:1) - А.

R2 0,54 (хлороформ:метанол:32% уксусная кислота 60:45:20) - Б.

R 0,33 (этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода 45:20:6:11) - В.

Карбобензокси фенилаланшт-глицил- аргинин (II). Через раствор 3,09 г (8,46 ммоль) продукта (I) в 35 мл

4

-vl

о

00 со

трифторуксусной кислоты в течение 1 ч. пропускают ток сухого бромистого водорода. Растворитель упаривают, к остатку добавляют 150 мл эфира, выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в воде и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит IRA-410 (ОН -форма) до отрицательной реакции на ио ны брома. Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом, водой, фильтрат упаривают, остатки воды удаляют азеотропной перегонкой с изопропиловым спиртом. Остаток растворяют в 25 мл диметилфор- мамида, к раствору добавляют 3,91 г (9,31 ммоль) п-нитрофениловог-о эфира карбобензокси-фенилаланина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Ди- метилформамид отгоняют, остаток расворяют в 5 мл метанола и продукт осаждают добавлением 300 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, пр мывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе.

Выход 3,75 г (86%) продукта, т.пл. 133-134°С.

17,2 (с 1, ДМФА).

R| 0,30 (A),R| 0,66 (Б), R3 0,43 (В).

Карбобензокси-глицил-фенилаланил глицил-аргинин (III). Продукт получают аналогично продукту (II), исходя из 2,71 г (5,28 ммоль) (II) и 1,93 г (5,83 ммоль) п-нитрофенилового эфира карбобензоксиглицина.

Выход продукта 2,46 г (82%), т.пл. 142-144 С.

1

(с) -17,3 (с 1, ДМФА). R 0,57 (Б), R2 0,35 (В),

0,45 (н-бутанол:муравьиная кислота: вода 15:3:1).

Карбобензокси-аланил-глицил-фенилаланил-глицил-аргинин ((IV). Про дукт получают аналогично продукту (II). Исходя из 2,46 г (4,32 ммоль) продукта (III) и 1,64 г (4,75 ммол п-нитрофенилового эфира карбобензо- ксиаланина получают 2,13 г (77%) продукта (IV), т.пл. 148-149°С.

(аС) -20,8 (с 1, ДМФА).

R 0,64 (Б), R 0,38 (В), R3 0,39 (н-бутанол:пиридин:аммиак

конц.:вода 20:12:3:15) - Г.

Карбобензокси-фенилаланил-аланил глицил-фенилаланил-глицил-аргинин (V). Продукт получают аналогично продукту (II). Исходя из«0,64 г

(0,99. ммоль) продукта (IV) и 0,46 г (1,1 ммоль) п-нитрофенилового эфира карбобензокси-фенилаланина, получают 0,63 г (81%) продукта V, т.пл. 150-153°С.

W 3,5 (с 1, МеОН).

R. 0,42 (А), Щ 0,70 (Б), R| 0,39 (В).

Фенилаланил-аланил-глицил-фенил- аланил-глицил-аргинин (VI), 0,63 г (0,80 ммоль) продукта (V) растворяют в 10 мл метанола и гидрирутот в присутствии палладиевого катализатора. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре .метанолом, упаривают, остаток переосаждают из 5 мл метанола эфиром (100 мл), сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный продукт вносят в колонку (600x15) с Сефадек- сом SPC-25 и фракционируют в градиенте пиридин-ацетатного буфера 0,05 М - 1,00 М.

Выход продукта 0,34 г (65%), т.пл., 154-156°С.

R ,

(ci.)D +8,4 (с 0,5, ). R| 0,58 (Б), R2 0,32 (Г), 0,44 (н-бутанол:пиридин:уксус0

5

0

з O

5

ная кислота:вода 10,5:6:1:7,5).

Данные аминокислотного анализа: фенилаланин 2,13 (2), аланин 1,00 (1), глицин 1,97 (2), аргинин 0,93 (1).

Индивидуальность синтезированного гексапептида подтверждена спектром ЯМР И методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Пептид элюируют одним пиком при 39,3% градиента на 12,8 минуте. (Колонка 250-4,6 мм, Spherisor BODS, 5/U, подвижная фаза Ai 0,05М , рН 3,0; В:С1ЦСЫ; grad. 20 В за 20 мин; давление 1500 psi, скорость 1мм/мнн} детекция при 214 мм).

Проведены биологические испытания предлагаемого гексапептида.

Изучение гепатопротективного действия гексапептида в сравнении с преднизолоном проведено на 48 мьшах- - самцах линии balb С.

Развитие острого гепатита вызывают у мышей, подвергнутых 12 ч голоданию, с помощью П-галактозамина гидрохлорида, который вводят в/б, разведенного в 0,1 мл физиологического раствора концентрации 700 мг/кг. Контрольная группа животных получала в/б 0,1 мл физиологического раствора. Животным, получавшим D-гапактозамин, сразу же после его выделения инъецируют предлагаемый гексапептид (100 мкг/кг), преднизолон (5 мг/кг) или физиологический раствор (0,1 мл) п/к. Повторные инъекции исследуемых веществ производят через 6 ч. Каждая из групп состояла из 12 животных. Забой мышей производят методом дека- пит ации, собирают кровь из шейных сосудов и в ее сыворотке определяют концентрации аланиновой трансаминазы (АЛТ) и глютаматдегидрогеназы (ГДГ).

Статистическую обработку полученных результатов проводят с помощью t-критерия Стьюдента. За достоверные- принимали различия на уровне значимости 95% (при РХО,П5). Полученные результаты представлены в табл.1. I

Как следует из таблИ, D-г.алак- тозамин вызывал достоверное повышение концентраций исследуемых ферментов (АЛТ в 1,5, а ГДГ более чем в 3 раза). Предлагаемый гексапептид практически полностью блокировал по- вьшение концентраисии АЛТ и в 2 раза по- - нижал концентрацию ГДГ. При введении преднизолона отмечена лишь недостоверная тенденция к снижению концентраций ферментов.

Предлагаемый гексапептид изучен в экспериментальной модели острого поражения печени у крыс самцов линии Вистар (78 особей), вызываемого с помощью четыреххлористого углерода. Крысам после 12 ч голодания вводят СС концентрации 1 мл/кг, разведенный в оливковом масле, в/б. После введения СС1 крысам инъецируют гексапептид в 4 различных дозах (10,30, 100 и 300 мкг/кг). Повторно гексапептид вводят через 6, 24 и 30 ч. Контрольная группа животных вместо

10

15

дозы. Особенно выраженно снижается более специфичный печеночный энзим ГДГ.

Предлагаемый гексапептид, кроме того, зависимо от дозы блокирует летальность крыс при использовании четыреххлористого углерода.

Полученные результаты представлены в табл.3.

Как следует из табл.3, если чет реххлористый углерод вызывает гибе 77% (10 из 13) животных, то при введении предлагаемого гексапептид в дозах 100 и 300 мкг/кг летальнос вовсе отсутствует.

Статистическую обработку при по жении печени, вызванном четьфеххло ристым углеродом, в отношении пока зателей энзимов проводят с помощью t -критерия Стьюдента, а в отношении летальности - с помощью критер Х Пирсона.

Во всех экспериментах с примене нием предлагаемого гексапептида не отмечалось изменений со стороны кл точного состава крови, основных ге модинамических показателей. При из чении острой токсичности гексапепт 30 да LD составляет 120 мг/кг.

Таким образом, в использованных экспериментальных моделях острого поражения печени предлатаемьм гекс пептид достоверно снижает в крови 35 концентрации ГДГ и АЛТ, повышение

которых характерно для патологичес го процесса, развивающегося в пече Это свидетельствует о наличии у ге сапептида гепатопротективных свойс 40 Преднизолон, использованный в обыч применяемой в клинике парэнтеральн дозе, не оказывал выраженного влия ния на концентрации ферментов. Соп ставление предлагаемого гексапепти

20

25

гексапептида получает физиологический 45 с соматостатином показывает, что раствор (О,2 мл). Все группы животных гексапептид превосходит последний

состоят из 13 крыс. В крови исследованы концентрации АЛТ и ГДГ.

Полученные результаты представлены в табл.2.50

Как следует из табл.2, СС1 вызывает достоверное повышение концентрации ГДГ. Повышение АЛТ не является статистически значимым в силу малого количества наблюдений. Гексапептид снижает оба показателя зависимо от

по эффективности - летальность 0% по сравнению с 20% у соматостатина максимально эффективная доза в 15 меньше (100 мкг/кг - для гексапептида, 1,5 мг/кг - для соматостатин

Наиболее распространенньп, применяемый при лечении заболевает п чени, препарат - преднизолон npiiMe 55 няют в дозе, в 50 раз превосходяще дозу предлагаемого гексапептида.

5

дозы. Особенно выраженно снижается более специфичный печеночный энзим ГДГ.

Предлагаемый гексапептид, кроме того, зависимо от дозы блокирует летальность крыс при использовании четыреххлористого углерода.

Полученные результаты представлены в табл.3.

Как следует из табл.3, если четы- реххлористый углерод вызывает гибель 77% (10 из 13) животных, то при введении предлагаемого гексапептида в дозах 100 и 300 мкг/кг летальность вовсе отсутствует.

Статистическую обработку при поражении печени, вызванном четьфеххло- ристым углеродом, в отношении показателей энзимов проводят с помощью t -критерия Стьюдента, а в отношении летальности - с помощью критерия Х Пирсона.

Во всех экспериментах с применением предлагаемого гексапептида не отмечалось изменений со стороны клеточного состава крови, основных ге- модинамических показателей. При изучении острой токсичности гексапепти- 0 да LD составляет 120 мг/кг.

Таким образом, в использованных экспериментальных моделях острого поражения печени предлатаемьм гексапептид достоверно снижает в крови 5 концентрации ГДГ и АЛТ, повышение

которых характерно для патологического процесса, развивающегося в печени. Это свидетельствует о наличии у гексапептида гепатопротективных свойств. 0 Преднизолон, использованный в обычно применяемой в клинике парэнтеральной дозе, не оказывал выраженного влияния на концентрации ферментов. Сопоставление предлагаемого гексапептида

0

5

45 с соматостатином показывает, что гексапептид превосходит последний

50

по эффективности - летальность 0% по сравнению с 20% у соматостатина, максимально эффективная доза в 15 раз меньше (100 мкг/кг - для гексапептида, 1,5 мг/кг - для соматостатина).

Наиболее распространенньп, применяемый при лечении заболевает пе- чени, препарат - преднизолон npiiMe- 55 няют в дозе, в 50 раз превосходящей дозу предлагаемого гексапептида.

Таблица 1

Гексапептид формулы Phe-Ala-Gly-Phe-Gly-Arg , обладающий гепатопротективным действием. С (О

Группа животных

113,6±5,5 32,5±:3,8

170,3+Ю, 121,6±16,0

-

115,2+14,3 104,5±10,1

115, i±5, 62,814,9

между 1 и 2 группами дос

между 2 и 3 группами дос

Таблица 2

Группа животных

АЛТ, ед

Виварный контроль

64,.6±3,3

CCl,

СС1д+ предлагаемьй

гексапептид

(10 мкг/кг)

CCl описываемый

гексапептид

(30 мкг/кг)

описываемый

гексапептид

(100 мкг/кг)

описываемый

гексапептид

(300 мкг/кг)

АЛТ, ед

ГДГ, ед

ГДГ, ед

17,210,6 5619,711201,7

1962,01494,7 1487,31301,5

874,31118,3

4

603,31118 0