Гексапептид, обладающий противоязвенным действием Советский патент 1991 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобратеиие относитсй к новому биологически активному соединению гексапепти- ду формулы I Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Glu-OH, обладающему противоязвенным действием, которое может найти применение в медицине.

Цель изобретения - поиск новых соединений пептидной природы, обладающих бо- лее высокой противоязвенной активностью при пероральном применении и низкой токсичностью.

П р и м е р 1. Ди-грет-бутиловый эфир карбобензоксилейцил глутаминовой кислоты (i).

6.83 г (17,41 мМ) ди-трет-бутилового эфира карбобензоксиглутаминовой кислоты растворяют в 35 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом, фильтрат упаривают, растворяют в 25 мл диметмл- формамида СДМФА). К раствору добавля ат 4,50 г (17Л1 мМ) п-нитрофенилозогс эфира карбобензоксилейцина. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Растворитель упарм- аают, остаток растворяют а 10 мл смеси этилацетат:гексан (2:1) и наносят на хрома- тографическую колонку Lobar С (440-37) LiChroprep Si 60(63-125 мм)- Merck(ФРГ), Хроматографию производят в мзократкче- ском режиме (элюэнт - этилацетат:гексан 2:1). Фракции, содержащие целезой продукт, собирают, упаривают, сушат а вакуум- эксикаторе. Получают 6,02 г (68%) продукта. Бесцветное масло -24.2° (С i. ДМФА), Rf : 0,22 (этилацетат:н-гексан :2 (А)), 0,61 (толуол:ацетон:мотэнол:уксусн8я кислота 14:1:4:1 (Б)), 0,50 (толуол:н-геп- тан:метилзтилкетон 5:3:1 (В)).

Сй

у

if )Л5

Ди-трет-бутиловый эфир карбобензок- сифенилалания-лейцилглутаминовой кислоты (П),

1.56 г (3,09 мМ) (I) растворяют в 10 мл метанола и гидрируют в присутствии палла- диевого катализатора в течение 3 ч. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом и фильтрат упаривают. Остаток растворяют в 5 мл ДМФА, добавляют 1,30 г (3,09 мМ) п-нитрофенилового эфира карбобензоксифенилаланина. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Растворитель упаривают, остатрк растворяют в 30 мл этилацетата. Этилацетат промывают 2%-ной серной кислотой (20 млх2) и водой (20 млх2), упаривают, добавляют 25 мл изо- пропилового спирта и упаривают. Остаток растворяют 8 димзопропиловом эфире, выпавшие кристалг1ы отфильтровывают, про- мывают на фильтре димзопропиловым эфиром м сушат 3 вакуум-эксикаторе. Получают 1.55 г (85%) продукта с т.пл. 120°С. -25,6° (С1, ДМФА), Rf: 0.23 (А), 0.56 (Б), 0,29 (В).

Карбо5ензокси-Д-аланил-глицил (fii).

0,50 г (7,68 мМ) глицина растворяют в 7,68 мл 1 к. раствора едкого натра и добавляют раствор 2,74 г (7,78 мМ) п-нитрофени- лового эфира к.зрбобензо(си-Д-аланмна в 20 мл ДМФА, Реакционную с.адесь перемешивают fipti комнатной температуре в течение суток. Раствор упаривают, остаток растворяют в воде, экстраг.руют зфирсы (50 ), В.ОДНЫЙ слой подкисляют 2 н, сер- ной кислотой до рН 2 и экстрагируют этмлацетзтом (50 мл х 3). Зтилацетэт промывают водой (30 мл X 2), добавляют 50 ил изопропмлового спирта и упаривают. Остаток заливают эфиром (100 мл), образовав- шиеся кристаллы отфильтровывают, промывают на фильтре м сушат в вакуум- 3KCvi caTODs. Получают 1,40 г ( 65%) продукта с т.пл. 126,5-127°С. аЬ +20 ,7° (С1, МеОН), RP : 0,67 (хлорофорг :метанол:32%- ная уксусная кислота 60:45:20 (Г)), 0,71 (эти- лацвтат:пиридин:уксуская кислота: вода 45:20:6:11 (Д)), 0,35 (хлористый метмлен:ме- танол:50-ная уксусная кислота 85:15:2 (Е)).

N-трет-бутилоксикарбонил-о-бензил- тирозил-Д-алзнил-глицин (IV).

1,66 г (5,90 мМ) (it) растворяют в 20 мл метанола и гидрируют в присутствии палла- диевого катализатора в течение 3 ч. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом, фильтрат упаривают, остаток растворяют з 5,90 мл 1 н. раствора едкого натра. К раствору добавляют 2,91 г (5,90 мМ) п-китрофенилового эфира N-третбутилоксикарбонил-о-бензил-тирозина в 25 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Раствор упаривают, остаток растворяют в воде, экстрагируют эфиром (50 мл X 2), водный слой подкисляют 2 н, серной кислотой до рН 2 и экстрагируют этилаце- татом (70 мл х 3). Этилацетат промы1зают водой (50 мл X 2), добавляют 50 мл s/зопро- пилового спирта и упаривают. Остаток заливают эфиром (150 мл), образовавш /,есп кристаллы отфильтровывзют, промывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-зкс лка- торе. Получают 2,62 г (89%) про.п,укта с т.пл. 100-100,5°С,аЬ -9,3° (С1, ДМФА), Rf: 0,74 (Д), 0,57 (Е), 0,36 (хлороформ:метг,- нол:уксусная кислота 9:1:0,5 (Ж)).

п-Нитрофениловый зфир М-трет-бути- локсикарбонил-о-бензил-тирозил-Д-апанил- глицина (V).

3,50 г (7,03 мМ) (IV) и 1,02 г (7,ЗЗмМ) п-нитро.фенола растворяют з 25 мл ДМФА, раствор охлаждают до , добавляют 1,54 г (7,33 мМ) диц иклогеко лкарбодиими- да в 10 мл ДМФА. Реакционную смесь пере .мешивают при -25°С а течение 45 мин, затем температуру доводят до 0°С и выдерживают при этой температуре в течение суток, Ev- nssusKe кристаллы fli iU /jK/JoroKCHflMOHeBi/iiibi отфильтровывают, промывают на фильтрате ДМФА. фильтрат упаривают, остаток пере- кристаллизовывают из иэопропилоБсго спирта. Получают 3,63 г (83%.) продукта с т.пч. 154 C/ a D ° -0,4 (С1, ДМФА). Rf: 0,87 (Е), 0,69 (х.пороформ:метанол:уксусиая кислота 32:2:1) 0,41 (н-бутэнол:муравь-инзя кислота:вода 15:3:1).

Дк-трет-бутиловый эфир N-трет-бути- лoкcи capбoнv1л-o-бeнзил-тйpoэил-o-aлaнi/ л -глицил-фенилаланил-лейцил-глутам лновой

Х /1СЛОТЫ (VI).

209 мг (О.,32 мМ) (il) растворяют Б 15 мл метанола и гидрируют в присутствии палла диевого катализатора в течение 3 ч. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом, фильтр упаривают. Остаток растворяют в 10 мл ДМф.А и добавляют 200 мг (V). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение суток. ДМФ.А упаривают, остаток дважды переоса: кдают из метанола (5 м.п) эфиром (300 мл), получают 266 мг (84%) продукта с т.пл. 200-201 °С, а -19.2 (С1. ДМФА), Rf: 0,88 (Г). 0.89 СД), 0,58 (Ж).

Тирозил-Д-аланил-г.пицил-фенилаланил- -лейцил-глутаминовая кислота.

240 мг(0,24 мМ) (Vi) растворяют в 15 мл уксусной кислоты и гидрируют В присутствии палладиеаого катализатора в течение 3

ч. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре уксусной кислотой и фильтрат упаривают. Остаток растворяют в 15мл трифторуксусной кислоты и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают, остаток заливают 50 мл эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают нз фияьтре эфиром, растзоряют в 50 МП 10%-:ю уксусной ;йс. 1сты и обра- батызают монс с беленной смолой Dowex-l вАсО-форг«с, Сг ча у з фильтровыБают, про- ; - :t, на фильтре 1Q%-How уксусной кис- , Фиььгрдт упэривзюг. Полученный г родукт оч /1:дак;т методо -1 -гфотивоточного ргсп егеля- мя нй планетарной центрифуге Б систаг-4е н-б --&иол:уксусная кислота:вода 4:1.5, ст-:ципнзр;;зс - оргз 1 ческзя. Фракции, содержащ /в цэлевсй продукт, со- , . добавляют 50 мл мзо- прспмлоЕСго спирте, упаризают остаток, переосаждают из ме7:-:нола (3 мл) эфиром (250 4л}, образовавшийся осадок отфильтровывают, .iQT на фильтре эфиром, cyiLiST S вакуу;.-;--экс дка7рре. Получают 92 мг (55%) Г5ро,-|укт&, al-r + 29,8° (С1, 10% АсОИ), Rf : 0.74 (П G.42 (Д), 0,48 (н-бута- нол:уксу-нзя к слстз зода 3:1:1). Данные гмкнок юлотного ь нг- ада: яланин 1,02 (S), raHiii.5H 1,ОС if), :::ут:; ммнозая кислота 1,04 (1), ..-ейц-1н 1,02 п, .розин 0,99 {I), фенила- naHi/iH 1,03 (Г) A -HHfciR рысскозффективной жидкое ой гро. тсграфм /; : пептид элюи- розэяся одкк пьг.он f. 38,24% градиента на 2,15 , :. 250 х 4.6. имг Ultrasphera ODS bf.-, :юдв1/1жная фаза А:Ч).05. М KH fOA, е.; СНзС, g-ad В за 20 MVIH, даз ;е;-те 150U роГ скорость 1 мл/мин, детекцу1й лрм 21 ;- -м.

у йндйв дуальность полученного соединенг й подтверждают спектром ПМР.4

Проведены омологе ческиз испытания описываемого гэксапептмда.

П р и Q р 2. Испытания протизоязвен- ного дейстйчй гексапептмд2 проводят на крысах самцах линии Висгар. Развитие яз- 4 венных поражений двенадцатиперстной кишки у крыс вызьвьают путем подкожного введения цистеа. мна гидрохлорида в дозе ЗоО мг/кг, разведенного в 0,5 мл физиологического растэорз. Сразу же после введе- 5 ПИЯ цистезмг/1на гидрохлорида и через 6 ч крусам с помощью зиутрижелудочного зонда вводя анутр. пред/1агаемый гексапеп- тид 8 дозах 10 и 100 рлкг/кг, деларгин в дозе 100 адкг/ чг или ци.ютидмн в дозе 10 мг/кг, 5 растворенные в 0,5 .п .3 % -него молока, разведенного в 5 раз физиологическим раствором. К-энтрогвьной группе животных после взеден1яя цг стеар ина гидрохлорида вводят внутри 3%-ное iv ujTOKo, разведенное в 5 раз

физиологическим раствором. Забой животных производят методом декапитации через 24 ч после введения цистеамина гидрохлормдз и с помощью бинокулярной яупы ( х8) оценивают состояние слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Для групп;:. крыс подсчитывают среднюю тяжесть поражения (ТП), выраженную Е баллах (О - отсутствие зрозивно-язвенных I пспа«ен5 - ; 1 - эроги: ; 2 - единичная язва: 3 - множестеенные язвы, 4 - прободные язвы). того, в каждой группе опре.це- rsvGv час-о ; поражений (ЧП), которая пред- сп э;;яег собой отношение числэ животн ых с язвами к: общему числу выживш тх к концу з;-:с;;вси л8нта животных. В качестве сум- .4зрнаго показателя яззоооразования опре,ССйЯ:ОТ условный ЯЗЕвННЫЙ мНЦеКС (ЯП)

; ра;&нь йДП±(;2 X ЧП).

Статист /чес(а юобработку полученных ре- Зуль гтс1в прчоводят с помощью t-критгрия Сть1одентз (дня ТП) и Х -критерия Пирсона Саля ЧП). За Асстоверныа принимают разли- ия на уровне значимости 95% (при .05). Пслу-екные результаты представлены в

TfiPf .l.

Кэ. следует из та5л,.1, предлагаемый гэ;сс2г;зг.тид i-spn введении анутрь зависимо 07 /:.3L-; предотаращэет язЕоо 1рэзование в дчензАцатиперстной ккшке крис и снижает ЯИ в дэзз 100 кг/к1 на 63%. Противоязаен- ная asTi iBRocTb гексапепт лдэ в дозе 100 мкг / сг была есг олько выше противоязвенной актг/ зкости циметидина в дозе 10 мг/кг. Деларгин при знедении внутрь обладал сла- противоязвенные , действием, снижая ЯИ пугшь -13 26%, это снмхекио не являлось статиче . знач;лмым.

П р и и е р 3. Гексапептид I был -изучен в зксгериментально модели индаметаци- Hosb K Яов тонкого кишечника, где протиао- язвенное действие гексапептида сра8Н..з,ли с противоязвенныр действием сульфзсалызина. Индометацин вводят кры- иа.г знугрь в дозе 20 мг/кг с помощью внут- рижелудочного зонда в виде суспензии в 0,5 мл физиологического раствора. Предлагаемы ;, гексйпептид з дозе 100 мкг/кг или суль- фасйтззмн в дозе 200 мг/кг вводят сразу же и через 6 ч гюсле введения индометацина з 0,5 мл разбавленного а 5 раз физЕ ологиче- ским раствором 3%-ного молока. Контрольной группе животных сразу же и через 6 ч после введения индометацина вводят внутрь 3%-ное молоко, разведенное в 5 раз физиологическим раствором. Забой животных методом декапитации производят через 24 ч после введения мндометацина и подсчитывают с помощью бинокулярной лу- т, ксл.1чество язвенных дефектов слизистой оболочки 30-сантиметрового дисталь- ного отрезка тонкой кишки, где возникновение язв было максимальным. Для каждой группы определяют среднее число язв в кишечнике.

Стат стическу о обработку полученных результатов проводят с помощью t-крите- рия Стьеодента. За достоаеркьзе принимают различия на уровне значимости 95% (при ,05). Полученные результаты представлены эта6л.2/

Как следует из табл.2, предлагаемый

ГЗКСЗПеПТМД I. МСПОЛЬЗОВЭННЫЙ в ДО39 100

мкг/кг, снижает средаее количество язв s дмстальной части тонкого кишемнихз крыс на 52%. Противоязвенная активность предлагаемого гексапептида I не уступает противоязвенной активности сульфасалазина, примененного в дозе 200 мг/кг. который уменьшает количество язв в кишечнике на

46%.

Во всех зкспериментах с применением

предлагаемого гексапептида I не отмечалось изменения со стороны клеточного состава крови основных гемодинамических показателей. Острая токсичность предлагаемого гексзпептида I LDgo составляет 250 мг/кг.

Тзки образом, синтезирован новый гексзггептид фор.1улы L который обладает нмзкой токсичностью, болееуки ерсальнык

прот чвоязвеккым действием, чем uwE Jseri - дмн i/чли сульфэсйлазин, превышает SKTMS- кость 3T3-IX препаратов э 100 м 2000 раз.

Таблица 1

Гексапептмд формулы Tyr-D-A a-G y- Phe-Leu-Gfu-OH, обладающий противоязвенным действием.

Влияние гексзпептеда I, циметидина м деларгмна на возкмкнозение цмстеаминовых дуоденальных язв при приеме внутрь

Различие с контрольной группой на уровне зн8Ч11мос7и 95% (при Р 0,05}

3 б л и ц а 2

Влияние предлагаемого гексапептида и сульфасалазина на развитие индометационовых язв в тонком кишечнике крыс.