Способ получения бактериальной холинэстеразы Советский патент 1989 года по МПК C12N9/16 C12N9/16 C12R1/38 

1

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, а точнее к технологии получения внеклеточной бактериальной холинэстеразы.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение чувствительности к ингибитору - эфиру карбаминовой кислоты прозерину.

Сущность изобретения заключается в том, что в качестве продуцента хо- линэстеразы используют культуру Pseudomonas aurantiaca-875 из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (БКМ),.

в качестве антихолинэстеразного вещества используют прозерин (эфир карбаминовой кислоты) в концентрации 10 М. Антихолинэстеразную актив-г , ность соединений выражают величиной р1 50, которая соответствует отрицательному логарифму молярной концентрации вещества, вызывающей угнетение холинзстеразы на 50%.

Пример 1. Процесс получения внеклеточной бактериальной холинэсте- разы, чувствительной к прозерину

4

1С

СП

о to

3147

(простигмину) проводят следующим образом.

Культивирование продуцента Pseudo- monas aurantiaca ВКМ-875 осуществля- ют в условиях аэрации на питательной среде следующего состава, (%): фруктоза 0,8; калий фосфорнокисльш двух-- замещенный 0,1; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1; магний сернокис- лый 0,03; кальций хлористый 0,01; .натрий хлористый 0,01; дрожжевой экстракт 0,05; аммоний фосфорнокислый двухзамещенный 0,2 (по азоту);.ацетил- холин 0,2 при значении рН среды рав- ном 7 - 7,2. Инокулят вносят в расчете 10% по объему. Выращивание проводят в 700 мл колбах с 50 мл среды на качалке при t 28 С в течение 72-86 ч. Выросшую биомассу отделяют центрифУ гированием. В супернатанте определяют

активность холинэсте азы по ацетилти- охолину в качестве субстрата и чувствительность к прозеринуо Выбор продуцента внеклеточной холинэстеразы проводят в три этапа. На первом этапе культуру бактерий выращивают на мясопептонном агаре (МПА) с добавлением 0,2% ацетилхолина в течение 24 ч. Выросшие клетки суспендируют в буфере и определяют эстеразную активность по скорости гидролиза индофе- нил ацетата (ИФА). Активность фермента клеток выражают в условных единицах-минутах, необходимых для перехода неокрашенного субстрата ИФА в окрашенный продукт индофеноло

Эстеразная активность клеток исследованных продуцентов приведена в табл.1.

Таблица 1

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а точнее к технологии получения внеклеточной бактериальной холинэстеразы. С целью упрощения способа и повышения чувствительности к ингибитору-эфиру карбаминовой кислоты - прозерину в качестве продуцента холинэстеразы используют культуру PSEUDOMONAS AURANTIACA КМ-875, которую выращивают на жидкой аэрируемой среде, содержащей ацетилохолин в качестве индуктора, с последующим выделением конечного продукта и оценкой чувствительности фермента к ингибитору-прозерину в концентрации 10^-6 М. Преимущество предложенного способа заключается в том, что полученная бактериальная внеклеточная холинэстераза гидролизует ацетилтиохолин и ингибируется прозерином (в концентрации 10^-6М) за 30 мин, т.е. полученный целевой продукт имеет чувствительность к прозерину на 3-4 порядка выше, чем у фермента, получаемого известным способом. 3 табл.

В качестве возможных продуцентов холинэстеразы отбирают культуру, клетки которых гидролизуют ИФА не более, чем за 2-3 мин. На 2-м этапе выбор продуцента проводят по эстеразной активности фермента нативного раствора после отделения клеток центрифугированием. Выращивание отобранных на

1 этапе продуцентов проводят на мясопептонном бульоне (МПБ) с добавлением 0,2% ацетилхолина в колбах, на качалке при в течение 72 ч. Клетки отделяют центрифугированием, активность фермента измеряют по скорости гидролиза ИФА и ацетилтиохоли- на.

Как следует из приведенного примера., синтез внеклеточной холинэсте- разы начинается в конце первых суток и продолжается в течение четырех последующих, Макси альную активность наблюдают к 96 ч роста культуры.

Определяют чувствительность синтезированной холинэстеразы к эфиру карбаминовой кислоты (йрозерину), Ве- пичина р lyj равна 6,0

50

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что полз енная бактериальная внеклеточная холинэсте- раза гидролизует ацетилтиохолин и ин- гибируется прозерином в концентрации 10 М за 30 мин, т.е. полученный це- gg левой продукт имеет чувствительность к эфиру карбаминовой кислоты (прозе- рину) на 3-4 порядка вьше, чем у фермента, получаемого изве стньм способом.

7 , 14725028

Формула и зобретенияс последующей оценкой чувствительСпособ получения бактериальнойности фермента к ингибитору прозерихолинэстеразы, предусматривающий куль-ну, отличающийся тем,

тивирование продуцента на жидкойчто, с целью упрощения способа и поаэрируемой питательной среде, содер- вьшения чувствительности к прозерижащей ацетилохолин в качестве индук-ну, в качестве продуцента используют

тора, выделение конечного продуктаPseudomonas aurantiaca БКМ-875.