Реагент для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/00 C12N9/10 

ченнзш смесь реактивов наносят на гидрофобную поверхность полимерной пленки в виде капель, которые поли- меризуются высу1ииванием при комнатной температуре Соль органической кислоты (ацетат натрия, цитрат натрия, малонат ,натрия) вводят в реагент в качестве специфического субстрата, бромтимоловый синий играет роль индикатора рН реакции, указывающий на образование щелочных продуктов при ферментации субстрата ферментом микробов. Желатин способствует фиксации комцонентов реагента к . гидрофобной-поверхности полимерной пленки и одновременно вместе с гид- ролизатом казеина и субстратом служат питательными веществами для микробов. Это приводит к росту и размножению микробов, а следовательно, при наличии у последних специфических ферментов (ацетатазы, цитратазы, ма- лонатазы), к увеличиванию их количества (массы) , что способствует ус- корению ферментации субстратов и повышению чувствительности реагента. Это дает возможность определить аце- татазу, цитратазу и малонатазу 10- .100 микробных клеток в 1 мл в тече- ние 7-9 ч. Бумага с гидрофобным полимерным покрытием служит носителем реагентов. Это создает возможность контакта микробной культуры с реагентом в микрокаплях, приводит к быстрому растворению ингредиентов и ферментации субстратов соответствующими ферментами микробов.

В табл.1 представлена чувствительность реагента для определения ацета- тазы, цитратазы и малонатазы микробов. Реагенты, содержащие ингредиенты вне пределах граничных значений, имеют более низкую чувствительность,

В табл.2 представлена чувствительность реагента для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов в зависимости от количественных соотношений ингредиентов.

П р и м е. р 1 . Из листа бумаги с полимерной пленкой вырезают диск диамером 10 см. На пленочной поверхности расчерчивают 3 ряда по 5 зон площадью 2,0 X 1,5 см (1 ряд зон для реагентов на ацетатазу, 2 ряд - на. цитратазу, 3 ряд - на малонатазу). В 1 пробирку берут навеску порошков ацетата

натрия О,1 г и гидролизата казеина сухого 0,1 г, во 2 пробирку - цитрата натрия 0,1 г и гидролизата казеина сухого 0,1 г., в 3 пробирку - малоната натрия 0,1 г и гидролизата казеина сухого 0,1 г. Параллельно готовят растворы желатина и бромтимолового синего. Для приготовления раствора желатина 10%-ного в 4 пробирку вносят навеску желатина пищевого (ГОСТ 11293-78) (1,0 г) и заливают дистиллированной водой (9,0 мл), вьщержива- ют 60 мин, нагревают, не доводя до кипения, при непрерьшном помешивании стекляной палочкой до полного растворения. Для приготовления раствора бромтимолового синего 0,5%-ного в 5 пробирку вносят навеску порошка бромтимолового синего водорастворимого (ТУ 6-09-2045-77) (0,05 г) и заливают дистиллированной водой (10,0 мл), встряхивают до полного растворения. Затем в 1 2, 3 пробирки вносят растворы желатина 10%-ного и бромтимолового синего 0,5% по, 1,О мл и забуференного физраствора рН 5,4-5,6 по 7,8 мл. Пробирки со смесями ингредиентов помещают на водяной бане при 80°С. Полученные растворы охлаждают до комнатной температуры, после чего их наносят по 1 капле объема 0,02 мл в центр каждой зоны соответствующего ряда диска (раствор с ацетатом натрия из 1 пробирки наносят в зоны 1 ряда, раствор с цитратом натрия из 2 пробирки - в зоны 2 ряда и раствор с малонатом натрия из 3 пробирки - в зоны 3 ряда), После этого, диск оставляют при комнатной температуре до полного высыхания капель и пол учения фиксированных микропленочных реагентов,

Готовые реагенты хранят в полиэтиленовых мешочках при комнатной температуре .

По мере надобности реагенты исполь з уют для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов. С этой целью диск помещают в чашку Петри, а на поверхность реагентов наносят по 1 капле изучаемой микробной i культуры, содержащей от 10-100 клеток и более в 1 мл физраствора рН 6,5. При этом, можно изучить как микробную культуру со скошенного агара, так и колонию. Чашку закрывают и инкубируют при 37°С. При положительной

реакции, как результат ферментации ацетата натрия, цитрата натрия или малоната натрия, цвет капли переходит из желтого в синий, а при отрицательной реакции остается без изменений.

Пример 2, Б табл.5, 6, 7 представлены результаты испытания предложенного реагента для конкретных штаммов микроорганизмов,

В табл.3 дана чувствительность реагента и системы индикаторной бумажной с цитратом натрия,

Чувствительность реагента и системы индикаторной бумажной с малонатом натрия представлена в табл.4.

Pseudomonas eruginosa АТСС27853, Citrobacter freundi 120001, Xlebsiel- la pneumoniae 180104 - продуцентов аце

татазы, малонатазы и цитратазы, пока- зывающие более выгодную чувствительность реагента по сравнению с известным . I

Реагент для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов позволяет определить ацетатазную активность, цитратазную активность и мало- натазную активность микробов при концентрациях от 10-100 микробных клеток в 1 мл в течение 7-9 ч, а при концентрациях более 1 млрд/мл - В течение 2-5 ч.

Предлагаемый реагент предназначен для ускоренного определения ацетата- зы, цитратазы и малонатазы при биохимической дифференциации микробов кИ

06

шечного семейства и других, и обладает значительно повышенной чувствительностью. Кроме того, реагент более удобен для применения в лабораторной практике, особенно, в поход- но-полевых условиях и при массовых

исследованиях, так как его использование может исключать этап накопления чистой культуры, а следовательно, и уменьшаются сроки получения результатов анализа.

Формула из.обретения

Реагент для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов, включающий субстрат - натриевую соль органической кислоты, забуференный физраствор с рН 5,4-5,6, и индикатор- бромтимоловый синий, о т л и ч а ю- щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности, он дополнительно содержит сухой гидролизат казеина и желатин при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Натриевая соль

0,9-1,5

0,8-1,2 0,8-2,0

0,04-0,06

Остальное

Изобретение относится к микробиологии, а именно к реагентам для определения ферментативной активности микробов. С целью повышения чувствительности реагента для определения ацетатазы, цитратазы и малонатазы микробов последний помимо субстрата- натриевой соли органической кислоты, индикатора - бромтимолового синего и забуференного физраствора СРЕдСТВОН 5,4-5,6, дополнительно содержит сухой гидролизат казеина и желатин при следующем соотношении компонентов, мас.%: субстрат 0,9-1,5

сухой гидролизат казеина 0,8-1,2

желатин 0,8-2,0

бромтимоловый синий 0,04-0,06

забуференный физраствор СРЕдСТВОН 5,4-5,6 - остальное. Реагент обладает повышенной чувстивтельностью и позволяет определить соответствующую активность микробов при концентрациях 10-100 микробных клеток в 1 мл в течение 7-9 ч, а при концентрациях более 1 млрд/мл - в течение 2-5 ч. Реагент предназначен для биохимической дифференциации микробов кишечного семейства и удобен в походно-полевых условиях, т.к. его использование может исключать этап накопления чистой культуры, что ведет к уменьшению сроков получения результатов анализа. 7 табл.

Примечааие. ++ Реакция положительная, + реакция слабоположительная, - реакция отрицательная.. .

Таблица 1

Ковдент- рация Микробных кле- тох в I мл

Скорость ферментации ацетата натрия

реагент

1 ч

Система индикаторная бумажная

10

1010

10

10

10

10

10

10 3x10

2 ч|з ч k .4 J5 ч 6 ч 7 ч|8 ч 9 ч J24 ч I ч 2 ч J3 чТдч Is ч|б ч J7 ч J8 ч Ь ч 124 ч

------+ +Ч- ++++--- -- - + ++++ч- - --.----4-- f++ .++--- - - - - «. ++ 4+ М- - - - + ++++++

- - - . 4+ ++ + 4+ ++++++++++

++ ++ ++ 44- 44

44 44 44 44- - -М-+44444444444444+

--+4 +444

-+ ++ 44- 4444

4 44 4 44 44 44 44 44 4+ .3x10 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44

Концентрациямикроб- иых клёСкорость ферментации маловата натрия

Реагент

Система индикаторная бумажная

ных кле- г--гг«--11 j J.--,-.„«

,. г г Р f Ji.T l 1 г г г р -iр ч1Гч 8 ч |9 ч 24 Г

,.- ---- .-„ ,.«.-.«,..

10 10 10 10 10 10 10 lO 10°

3x10++ ++ 4+ +4 4+ 4+

++++4-+4

- - - - - +++4444

«++4+++

- - 4++4+44

+++4444

4 44 44444444

- - - 4 4 44 44444444

4 44 44 -44 44 44444444

4 44 44 44 44 44 4444А44

44444444

- - 4 +4 4 44 44 44

ГгГ72506

10

Таблица 5

Система индикаторная бумажная

--+4 +444

-+ ++ 44- 4444

Таблица (

Таблица 7

Система индикаторная бумажная

--,-.„«

- - 4 +4 4 44 44 44