1
(21)3701787/30-13
(22)16.01.84
(31)458402
(32)17.01.83
(33)US
(46) 30.07.90. Бюл. № 28
(71)Монсанто Компани (US)
(72)Роберт Томас Фралей, Роберт Брус Хорш, Стивн Гэри Роджерс (US)
(53)575,224.2:577.2(088.8)
(56)Ti plasmids and Directed Genetic Engineering Molecular Biology of Plant Pumor, изд. G Kahl and G.S. Schell, 1982, p. 537-548.
(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОК ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ
(57)Изобретение относится к биотехно логии, в частности к генетической инженерии растений. Целью изобретения является повышение выхода нормальных трансформированных растительных клеток, Способ заключается в том, что конструируют плазмиды рМОК 41, pMON 113, pMON 109, расщепляют их эндонук- леазами до образования целевых фрагментов, лигируют полученные фрагменты с образованием промежуточного вектора pMON 120. Плазмиду pMON 128 (или любую другую плазмиду, полученную путем включения химерного гена PMON120 вводят в Agrobacterium tumefaciens, содержащие Ti плазмиды. Контегратив- ные плазмиды переносят в растительные клетки, отбирают трансформированные растительные клетки и выращивают тран- трансформанты на среде до образования приростков.
с
SS
(/)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии растений. Целью изобретения является повышение выхода нормальных трансформированных растительных клеток. Способ заключается в том, что конструируют плазмиды PMON 41, PMON 113, PMON 109, расщепляют их эндонуклеазами до образования целевых фрагментов, лигируют полученные фрагменты с образованием промежуточного вектора PMON 120. Плазмиду PMON 128 (или любую другую плазмиду, полученную путем включения химерного гена PMON 120) вводят в AGROBACTERIUM TU MEFACIENS,содержащие TI плазмиды. Контегративные плазмиды переносят в растительные клетки, отбирают трансформированные растительные клетки и выращивают трансформанты на среде до образования приростков.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии растений.
Целью изобретения является повышение выхода нормальных трансформирован. ных растительных клеток.
Конструируют ряд плазмид.
pMON 41, с правым краем Ti плазмиды нопалинового типа и 5 участком гена нопалинсинтазы (NOS), pMON l09 с 3 участком NOS гена, и селектируемым маркерным геном /Spc/Str/, который позволяет осуществлять селекцию клеток A. tumefaciens, содержащих коин- тегративные Ti плазмиды с химерическими генами, pMON 113, с участком ДНК, последовательность которой идентична последовательности в участке Т-ДНК Ti плазмиды октопинового типа.
Каждую плазмиду расщепляют эндону- клеазами до получения целевого фрагмента. Лигируют полученные фрагменты и получают промежуточный вектор PMON 120.
Плазмида pMON 120 обладает следующими характеристиками.
Имеет три уникальных сайта рестрикции (Есо RI, Cla I, Hind III), реплицируется в нормальных клетках Е. coli. Однако не реплицируется в нормальных клетках Agrobacterium, без коинтеграции с другой плазмидой, например Ti плазмидой, которая реплицируется в клетках Agrobacterium.
О
Несет маркерный генэ который ко- диурет фермент, придающий устойчивость к двум антибиотикам, спектино- мицину (Spc) и стрептомицину (Str). Этот ген, названный Spc/Str ген, экс- прессируется в Е. и A. tumefa- ciena, но не в растительных клетках, не несет генов, которые кодируют устойчивость к ампициллину или тетра-ЦИКЛИНУа
Содержит последовательность, которая гомологична последовательности в участке Т-ДНК октотшнового типа Ti Гшазмиды.Ао tumefaciens. Эту последовательность называют левый внутренний гомологический (LIH) участок, Этот участок гомологичности промоти- рует акт скрещивания, в результате которого pMON 120 или такая производная pMON 120, как pMON 128, образует коинтеграт с ТЈ плазмидой, если обе Плазмиды существуют внутри одной и той же клетки А. tumefaciens. По определению коинтегратигвная плазмида образуется при простом акте скрещивания. Она содержит все последовательности ДНК, которые ранее существовали либо в Ti плазмиде, либо в плазми- де, полученной из pMON 120.
Содержит правьй крайний участок Т-ДНК нопалинового типа,, т.е. последовательность, которая способна функционировать , как один конец (для удоб ства обозначаемый, как правьй край)
to
15
20
25
30
расщепляют Hind III эндонуклеазой д получения различных фрагментов, вклю чая фрагмент размером 3,4 тыс, оснований, который обозначен как Hind 111-23 фрагмент. Этот фрагмент содер жит целиком NOS ген и правьй крайний участок Т-ДНК. Включают Hind III-23 фрагмент в плазмиду pBR 327. Получен ную плазмиду обозначают рНОМ 38 и расщепляют ее, В результате получаю фрагмент размером 2,3 тыс. основани которьй содержит правый крайний уча сток нопалинового типа и 5 участок NOS гена (включая промоторный участок, 5-нетранслированньй участок и часть структурной последовательности Этот фрагмент размером 2,3 тыс. осно ваний включают в плазмиду pBR 327, которую заранее расщепляют Hind III и Bam HI. Полученную плазмиду обозна чают рМОН 41.
Плазмида pMON 109 включает Spc/St селектируемый маркерный ген и 3 уча сток NOS гена до рМОМ 120. Ее конструируют следующим образом.
Плазмиду pMON 38 расщепляют Rsa I в результате чего получают тупые кон цы, как указано: 5 -С TAG, CAT G,
Выделяют фрагмент размером 1,1 ты оснований и расщепляют Bam HI до получения фрагментов размером 720 и 400 пар оснований, каждый из которых имеет один тупой Rsa конец и липкий Bam HI конец. Эти фрагменты добавляТ-ДНК последовательности, которая пе-35 ют к двунитевой ДНК из фага М13тр8,
ренесена из Ti плазмиды и включена в хромосому растительной клетки в процессе трансформации клетки при помощи A. tumefaciens.
которую расщепляют Stna I (которая да ет тупые концы) и Bam HI. Полученную смесь лигируют, трансформируют в клетки, Рекомбинантные фаги ДНК, коНесет ген,(включая промотор), кото 40 торые содержат фрагмент размером
рый кодирует экспрессию фермента, но- палинсин тазы (NOS), Будучи введен в растительную клетку NOS фермент катализирует продуцирование нопалина, типа опина,4
Часть коинтегративной Ti плазмиды (модифицированный участок Т-ДНК) вклю чается в растительный геном, т.е. только часть полученной из pMON 120 плаз- миды включается fe растительный геном. 5 Эта часть начинается с крайнего участка Т-ДНК и простирается в одном направлении только до участка гомологичности.
Размер плазмиды pMON 120 составляет около 8 тыс. оснований.
Нопалинового типа Ti плазмиду, обозначенную как pTi 137 плазмиду,
o
5
0
5
0
расщепляют Hind III эндонуклеазой до получения различных фрагментов, включая фрагмент размером 3,4 тыс, оснований, который обозначен как Hind 111-23 фрагмент. Этот фрагмент содержит целиком NOS ген и правьй крайний участок Т-ДНК. Включают Hind III-23 фрагмент в плазмиду pBR 327. Полученную плазмиду обозначают рНОМ 38 и расщепляют ее, В результате получают фрагмент размером 2,3 тыс. оснований, которьй содержит правый крайний сток нопалинового типа и 5 участок NOS гена (включая промоторный участок, 5-нетранслированньй участок и часть структурной последовательности). Этот фрагмент размером 2,3 тыс. оснований включают в плазмиду pBR 327, которую заранее расщепляют Hind III и Bam HI. Полученную плазмиду обозначают рМОН 41.
Плазмида pMON 109 включает Spc/Str селектируемый маркерный ген и 3 участок NOS гена до рМОМ 120. Ее конструируют следующим образом.
Плазмиду pMON 38 расщепляют Rsa I, в результате чего получают тупые концы, как указано: 5 -С TAG, CAT G,
Выделяют фрагмент размером 1,1 тыс. оснований и расщепляют Bam HI до получения фрагментов размером 720 и 400 пар оснований, каждый из которых имеет один тупой Rsa конец и липкий Bam HI конец. Эти фрагменты добавля5 ют к двунитевой ДНК из фага М13тр8,
которую расщепляют Stna I (которая дает тупые концы) и Bam HI. Полученную смесь лигируют, трансформируют в клетки, Рекомбинантные фаги ДНК, которые содержат фрагмент размером
720 пар, идентифицируют размером . вставки Bam HI-Sma 1„
Один из этих фагов обозначают как М-4. Фрагмент размером 720 пар оснований содержит 3 -нетранслированный участок (включая сигнал поли-аденили- рования) NOS гена и 3 участок структурной последовательности NOS гена, Фрагмент размером 720 пар оснований окружена в М-4 Eco RI и Pst I сайта- ми расщепления, которые присутствуют в М13 шр8 ДНК.
Бактериальный транспозон Тп 7, как известно содержит Spc/Str ген, упомянутый ранее. Тп 7 транспозон содержит также ген, который вызывает у клеток хозяина устойчивость к антибиотику триметоприму. Точное расположение и ориентация Spc/Str гена и гена устойчивости к триметоприму в Тп 7 неизвестны. Транспозон Тп 7 выделяют из штамма A. tumefaciens, в котором Тп 7 был включен з участок Hind III-23 плазмиды pTi T37,
Плаэмиду pGV 3106 расщепляют Hind III и фрагменты клонируют в pBR 327 плазмиды, расщепленную Hind III; Полученные плазмиды включают в
Е, coli клетки, отбирают клетки, которые были устойчивы к ампициллину (благодаря pBR 327 гену) и устойчивы к триметоприму (благодаря гену Тп 7). Плазмиду, полученную из одной колонии, обозначают как pMON 31. В этой плазмиде содержится вставка 6 тыс. оснований Hind III. Вставка содержала ген Spc/Str - устойчивости и ген устойчивости к триметоприму из Тп 7, и 3 участок гена NOS (который попал из pTi T37 плазмиды).
Размер плазмиды pMON 31 уменьшают дважды. Вначале уменьшение размера производят за счет расщепления плазмиды Eco P.I, удаляют фрагмент размером 850 пар оснований и осуществляют заново сшивку крупного фрагмента. Полученную плазмиду обозначают как рМОК 53, выделяют из трансформированных клеток, выбранных по их устойчивости к ампициллину и стрептомицину. Устойчивость к триметоприму не определяют, Размер плазмиды pMON 53 уменьшают путем расщепления плазмиды Cla I и удаления фрагмента размером 2 тыс. пар оснований и сшивки заново крупного фрагмента. Полученную плазмиду размером 5,2 тыс. оснований обозначают как pMON . Эта плазмида содержит Spc/Str ген.
Плазмиду pMON 54 расщепляют Eco RI и Pst I и выделяют фрагмент размером 4,8 тыс. оснований, содержащих Spc/Str ген. М-4 ДНК расщепляют Eco RI и Pst I и выделяют фрагмент размером 740 пар оснований, содержащий NOS нетранслированный участок. Эти фрагменты сшивают вместе до образования pMON 64. Плазмиду с нужной ориентацией идентифицируют путем расщепления Eco RI и Bam HI. Их обозначают как pMON 109.
Плазмида pMON 113 содержит участок гомологичности с pMON 120, который позволяет pMON 120 образовывать коин- тегритивную плазмиду, если она присутствует в A, tumefaciens вместе с
o
5
0
Ti плазмидой. Участок гомологичности выбирают из Ti плазмиды октопинового -- типа. 3 Ti плазмиде он расположен вблизи левого Т-ДНК крайнего участка, внутри Т-ДНК участка Ti плазмиды. Этот участок гомологичности обозначают как левый внутренний участок гомологичности (LIH).
Участок гомологичности получают из любого типа плазмиды, способной трансформировать растительные клетки. Конструируют промежуточный вектор, который может образовывать коинтег- ративную плазмиду с тем типом плазмиды, из которой был получен участок гомологичности.
Получают Е. coli культуру с pBR - производной плазмидой, содержащей Ват-8 фрагмент Ti плазмиды октопино- вого типа. Ват-8 фрагмент размером 7,5 тыс. оснований содержит левый крайний участок и LIH участок Ti плазмиды. Ват-8 фрагмент включают в
плазмиду pBR 327, которую расщепляют Bam HI.
Плазмиду pMON 90 расщепляют Bgl II и фрагмент размером 2,6 тыс. основа- нии, который содержит участок LIH, но
0 не содержит левый крайний участок, выделяют. Фрагмент размером 2,6 тыс, оснований обрабатывают полимеразой Кленова для превращения липких концов в тупые концы и полученный фрагмент
с расщепляют Hind III до получения фраг- мента размером 1,6 тыс. оснований (целевой фрагмент) и фрагмента размером 1 тыс. оснований. Оба фрагмента смешивают с pBR 322 плазмидой, которую
0 заранее расщепляют Pvn II и Hind III, Полученную смесь смешивают и включают в клетки Е. coli. Клетки отбирают на устойчивость к ампициллину и проводят поиск Sma J сайта, который находится
5 во фрагменте размером 1,6 тыс. оснований и которого нет во фрагменте раз-i мером 1 тыс. оснований. Колонию с целевой плазмидой идентифицируют и плаз МИДУ из этой колонии обозначают
0 PMCN 113,
Плазмиду pMON 41 расщепляют Pvn I и Ват I и выделяют фрагмент 1,5 тыс , оснований, содержащий правый крайний участок нопалинового типа и 5 участок NOS гена. Плазмиду pMON 109 расщепляют Bam HI и Eco RI и выделяют фрагмент 3,4 тыс. оснований, содержащий ген Spc/st и З1 участок гена NOS, Плаэмиду pMON 113 расщепляют Pvn I и Eco RI
и выделяют фрагмент размером 3,1 тыс. оснований, содержащий участок LIH.
Эти три фрагмента смешивают вместе и сшивают до образования рМОМ 120, Культуру бактерий Е« coli, содержащую pMON 120, депонируют в Американской коллекции типовых культур под № 39263,
Способ применения рМОЫ 120.
Плазмида рМОМ 120 имеет три уникальных сайта расщепления (Eco RI, Cla I и Hind III), которые пригодны для включения любого необходимого гена. Эти сайты расщепления расположены в участке рМОМ 120, который должен быть включен в растительный геном, так что включенный ген также будет включен в растительный геном.
Конструируют различные химерные гены, которые способны к экспрессии .бактериальных п олипсптидов и полипеп- ,тидов млекопитающихся в растительные клетки.
, Конструируют химерный ген, который (включает следующие ДНК последовательности,
Промоторный участок и 5 нетрансли рованный участок, полученный из гена нопалинсинтазы (MOS), Структурную последовательность, полученную из гена неомицинфосфотрансферазы II (NPT П). 3 нетранслированный участок, полу- ченньй из гена NOS.
Этот химерный NOS-NPT II-NOS ген выделяют на ДНК фрагменте, содержащем Eco RI концы. Включают его в Eco RI сайт плазмиды pMCN 120 и полученные плазмиды (с вставками химерическох о гена противоположной ориентацией) обозначают как pMON 128 и pMON 129 Плазмида 129 имеет две копии химерного гена. Каждую плазмиду исполь-. зуют для трансформации растительных клеток. Культуру Е. coli, содержаш,ую pMON 128, депонируют в Американскую коллекцию типовых культур, Этой культуре был присвоен регистрационный
номер 39264. i
Плазмиду pMON 128 (или любую другую плазмиду, полученную путем вклю-. чения целевого гена в pMON 120) вводят в микроорганизм, который содержит Ti плазмиду октопинового типа (или другую подходящую плазмиду)„ Подходящие микроорганизмы включают A, tume- faciens и A, rhirogenes, которые содержат Ti. или Hi плазмиды.
Плазмиду вставляют в микроорганизм трансформации или конъюгацией с клет
5
0
5
0
5
0
5
0
5
ками, которые содержат pMON 128 или другие плазмиды, Плазмида, такая как pMON 128 имеет участок, который гомологичен последовательности в Ti плаз- миде. Этот участок LIH гомологичности позволяет осуществлять единичный акт скрещивания, в результате которого рМСМ 128 и Ti плазмида октопинового типа объединяются с образованием коин тегративной плазмиды. Обычно это происходит с клеткой A, tumefaciens после того, как pMON 128 бывает включена в клетку. В другом варианте коинтегра- тивную плазмиду создают в клетке другого типа или in vitro, включают в A. tumefaciens или клетку другого типа, которая способна перенести коинте- гративную плазмиду в растительные клетки.
Плазмиду, такую как рМОМ 128, объединяют с Ti плазмидой с получением коинтегративной плазмиды 6, Культуру A. tumefaciens GV 3111, содержащую коинтегративную плазмиду, полученную из рМОМ 128 и Ti плазмиды дикого типа pTi B653,депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39266,
Если коинтегративную Ti плазмиду включают в растительную клетку, то в растительный геном может войти любой из двух участков ДНК, Т-ДНК,участок 14 или Т-ДНК 16,
Разрабатывают альтернативный способ, в котором избегают необходимости отделять опухолевые клетки от неопухолевых клеток, Выделяют некоторые мутантные штаммы A, tumefaciens, которые неспособны вызывать заболевание верхушечной галловой опухоли. Такие штаммы обычно называют безоружные Ti плазмиды. Ti или Ri плазмиды могут быть обезоружены в результате одного или более типов мутаций.
После того, как рЫОМ 128 включают в A. tumefaciens клетки, нужный акт скрещивания будет происходить в определенных участках клетки. Клетки, которые содержат коинтегративные плазмиды (независимо от того, вирулентные или обезоруженные) отбирают от других клеток, в которых скрещивание не происходит, следующим образом. Плазмида рМОМ 120 и ее производные содержат маркерный ген (Spc/str), который экс- прессируется в A. tumefaciens. Однако эти плазмиды не реплицируются в A. tu4 mefaciens. Поэтому spc/str маркерный
ген не наследуется стабильно в A. tu- mefaciens, если только включенная плазмида не объединится с другой пла- змидой, которая может реплицироваться в A. tumefaciens. Наиболее вероятной такой комбинацией за счет участка гомологичное™ является коинтеграция с Ti плазмидой. Клетки A. tumefaciens, которые содержат такую коинтег- ративную плазмиду, идентифицируют и отбирают при выращивании клеток на среде, содержащей либо Spc, либо str, либо оба вместе.
Возможен вариант, когда коинтегра- тивная Ti плазмида претерпевает по - следовательный акт скрещивания, в котором два участка L1H будут рекомби- нироваться. Такой акт нежелателен, так как он может привести к делению ДНК между LIH участками, содержащей химерический ген. Однако это повиди- мому не приводит к серьезным затруднениям по двум причинам. Во-первых, такой акт повидимому происходит с от- носительно невысокой вероятностью, примерно около . Во-вторых, плазмиду рМОМ 120 и ее производные конструируют таким образом, что селектируемый маркерный ген (spc/str) рас- положен в области ДНК, которая будет исключена при акте скрещивания. Поэтому селективные условия, которые используются для идентификации и . культивирования клеток Agrobacterium, содержащих коинтегративные плазмиды, должны быть достаточно жесткими для того, чтобы убить поколения клеток, которые претерпевают последующий акт скрещивания,, который исключает химерический ген из Ti плазмиды.
Только один из LIH участков в ко- интегративной Ti плазмиде будет включен в растительный геном.
Эта важная особенность определяет- ся конструкцией рМОК 120 и именно она отличает эту коинтегративную плазмиду от нежелательных коинтегративных плазмид, которые получали ранее, - Участок IF; который расположен вне Т-ДНК крайних участков, не будет включен в растительный геном. Это . приводит по крайней двум важным преимуществам. Во-первых, наличие двух участков Т.Н., включенных в расти- тельный геном, может привести к актам скрещивания, которые приведут к потере включенных генов- в трансформиро -- : ванные клетки и их потомство. Во-вто
0
0
, 5 д
5 Q „
5
0
рых, наличие двух участков ДНК гомо-ч логичности может значительно затруднить попытки анализа ДНК вставок в растительный геном.
Клетки A. tumefaciens, которые содержат коинтегративные Ti плазмиды с химерическими генами, идентифицируют и выделяют. Коинтегративные плазмиды включают в растительные клетки, которые подлежат трансформированию, под- вергают контактированию с ферментами, которые удаляют клеточные стенки. Это превращает растительные клетки в протопласты, которые представляют собой жизнеспособные клетки, окруженные мембранами. Эти ферменты удаляют и протопласты начинают регенерировать материал клеточных стенок. В подхо- 1 дящий момент времени клетки A. tumefaciens (которые содержат коинтегр а- тивные Ti плазмиды с химерическими генами) смешивают с растительными про топластами. Эти клетки совместно .- культивируют в течение промежутка времени, который позволяет A. tumefaciens инфицировать растительные клетки. После соответствующего периода совместного культивирования клетки A. tumefaciens убивают и продолжается рост растительных клеток.
Трансформированные растительные клетки отбирают различными способами, в зависимости от типа гена (генов), которые были включены в растительный
геном, i
Пример 1. Конструирование плазмиды pMON 41.
Используют культуру Е. coli, содержащую pBR 325 плазмиду с Hind III- 23 фрагментом pTi T37, включенным по Hind III сайту. 10 мкг плазмиды из этого клона расщепляют 10 ед. Hind III эндонуклеазы в течение 1 ч при 37°С. Фрагмент 3,4 тыс. оснований Hind III- 23 выделяют адсорбцией на стеклянных шариках после отделения от других Hind III фрагментов электрофорезом на 0,8%-ном агарозном геле. Выделенный 3,4 тыс. оснований Hind JII фрагмент (1,0 мкг) смешивают с 1,0 мкг плазмиды pBR 327 ДНК, которую заранее расщепляют Hind III эндонуклеазой (2 ед., 1 ч, 37 С) и щелочной фосфа- тазой теленка (0,2 ед., 1 ч, 37°С), депротеивизируют фенолом, осаждают этанолом и повторно суспендируют в 10 мкл ТЕ (10 мМ трис НС1, рН 8 г, 1 мМ ЭДТА). Одну единицу Т4 ДНК лигазы добавляют к фрагментированной смеси. Одну единицу определяют, как концентрацию, достаточную для получения более чем 90% циркуляризации одного микрограмма Hind III линеаризованной pBR 327 плазмиды за 5 мин при 22°С„ Смешанные фрагменты помещают в полный объем 15 мкл 25 мМ трис НС1 рН 8, 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитола, 200 мкМ спер мидина НС1 и 0,75 мМ АТР (лигазный буфер).
Полученную смесь инкубируют при 22°С в течение 3 ч, а затем смешивают с клетками Е, coli С 600 гее А56, которые получают трансформацией путем обработки СаС12. Для отбора трансформированные клетки распределяют на ZB пластины с твердой средой, содержащие ампициллин при 200 мкг/мл. После инку бирования при 3.7 °С в течение 16 ч получают несколько сотен клонов. Плаз- мидные мини-препараты выделяют из 24 клонов и полученные аликвоты плазмид- ной ДНК (0,1 мкг) расщепляют Hind III
для того, чтобы продемонстрировать наличие 3,4 тыс. оснований Hind III фрагмента, Однако из плазмид демонстрируют ожидаемую структуру и обозначают pMON 38, ....
ДНК получают с помощью тритон Х-10 лизиса и градиента CsCl, 50 мкг MON 38 ДНК расщепляют Hind III и Bam HI (50.,ед. каждая, 2ч, 37°С), и Hind Ill- Bam HI фрагмент размером 2,3 тыс. оснований выделяют. Выделенный фрагмент (1 мкг) смешивают с 1 мкг фрагмента Hind Ill-Bam HI размером 2,9 тыс, оснований pBR 327 вектора. После лиги рования (Т4 ДНК лигаза, 2 ед.) и трансформации Е. coli клеток получают 50 ампицилинустойчивьк колоний. ДНК из двенадцати плазмидных мини-препара тов расщепляют Hind III и Bam HI для установления наличия фрагмента размером 2,3 тыс, оснований. Одну плаз- мзаду нужной структуры выбирают и обозначают pMON 41,
Пример 2. Тридцать мкг плазмиды pHON 38 расщепляют Psa I (30 ед. 2 ч, 37°С) и 1100 пар оснований Rsal) фрагмент выделяют после разделения электрофорезом на агарозиом геле, используя метод стеклянных шариков, Raa I - Rsa I фрагмент 1100 пар осно- ваний (1 мкг) расщепляют 2 ед. Ваш HI эндонуклеазы и Bam HI инактивируют нагреванием. Эту ДНК смешивают с 0,2 мкг фага М13мр8 RF ДНК,, который
0
5
5
0
0 5
предварительно расщепляют Sma Bam HI (каждой по 2 ед. 1 ч, и 0,2 ед. телячей щелочной фосфатазы) После сшивки со 100 ед. Т4 ДНК лигазы и трансформации Е. coli J Й101 клеток, трансформированные клетки смешивают с мягким агаром и высевают в чашки в условиях, которые позволяют
идентифицировать рекомбинантный фаг. Отобрали двенадцать клеток, продуцирующих рекомбинантные фаги,и получают мини-препарат RF плазмид, RF ДНК расщепляют Ват НГ и Sma I для доказательства наличия Rsa I - Bam HI фрагмента размером 720 пар оснований. Одну из рекомбинантных RF ДНК, несущую . нужный фрагмент, обозначают М13 мр8 М-4.
Пример 3. Двадцать мкг плазмиды pGV 3106 расщепляют Hind III эндонуклеазой (20 ед., 2 ч, 37°С) и смешивают с 2 мкг pBR 327 расщепленной Hind III, После лигирования (Т
5 ДНК лигаза, 2 ед,) и трансформации Е. coli клеток, как описано ранее получают одну колонию, устойчивую к триметоприму (100 мкг/мл) и ампициллину. Обработка плазмидной ДНК из этой клетки демонстрирует наличие Hind III фрагмента размером 6 тыс. оснований. Эту плазмиду обозначают рМОМ 31,
Плазмиду pMON 31 расщепляют Eco RI эндонуклеазой (1 ед., 1 ч, 37 С), Эн- донуклеазу инактивируют нагреванием (10 мин, 70°С), Плазмидный фрагмент размером 8,5 тыс. оснований рецирку- лируют в реакции лигирования 100 мкл (Т4 ДНК лигаза, 1 ед.) и используют для трансформации клеток Е. coli с отбором устойчивых к ампициллину и стрептомицину (25 мкг/мл) колоний, Плазмидный мини-препарат ДНК из шести клонов расщепляют Eco RI для определения потери фрагмента 850 пар- оснований. Одну плазмиду, у которой не было Eco RI фрагмента 850 пар оснований обозначают рМОМ 53, Эту плаз, миду вводят в Е. coli GM42 дам-клетки (Balectal, 1979) описанной трансформацией.
Плазмиду рМОМ 53 (0,5 мкг) из мини-препарата, полученного из клеток, расщепляют Cla I и рециркулируют в разбавленном растворе. После трансформации Е. coli CM42 клеток и отбора устойчивых к ампициллину и спекти- номицину (50 мкг/мл) клонов, получают
5
пятьдесят колоний. Расщепление плаз- мидных мини-препаратов ДНК из шести колоний показывает, что во всех отсутствует фрагмент размером 2 тыс. оснований Cla I. Одну из этих плазмид обозначают рМОЫ 54. Получают плазмид- ную ДНК.
Плазмиду pMON 54 ДНК (20 мкг) расщепляют Eco RI и Pst I эндонуклеаза- JQ ми (20 ед. каждого, 2 ч, 37 С) и фраг мент размером 4,8 тыс, оснований очищают на агарозном геле, используя мембраны NA-45,
Очищенный фрагмент размером te 4,в тыс. оснований (0,5 мкг) смешивают 0,3 мкг фрагмента размером 740 пар оснований Eco RI - Pst I, полученного из М13мр8 М-4 RF ДНК, которую очищают, используя мембрану JQ NA-45. После лигирования (Т4 ДНК ли- газа, 2 ед.), трансформации Е. coli GM42 дам-клеток, и отбора клеток, устойчивых к спектиномицину, получают 20 колоний, Плазмидный мини-пре- 25 парат ДНК, полученный из 12 клонов, расщепляют Pst I и Eco RI для демонстрации наличия фрагмента 740 пар оснований. Одну плазмиду, несущую этот фрагмент обозначают рМОМ 64. -JQ
ДНК (0,5 мкг) pMON 64 расщепляют Cla I (1 ед., 1 ч, 37°С), затем Cla I инактивируют нагреванием и фрагмент заново присоединяют Т4 ДНК лигазой (1 ед.). После трансформации и отбора клеток, устойчивых к спектиномицину, получают мини-препарат из 12 колоний, ДНК расщепляют Bam HI и Eco RI для определения ориентации фрагмента 2 тыс. оснований Cla I, Половина клонов содержит Cla I фрагмент в обратной ориентации нежели в pMON 64. Одну из этих плазмид обозначают pMON 109.
Пример 4, Принимают плазмиду pNW 31C - 8,29С. Плазмида несет pTi A6 7,5 тыс. оснований Ват 8 фрагмент, Ват-8 фрагмент выделяют из 50 мкг Bam HI - расщепленной плазми- ды pNW 31C - 8 290, используя NA-45 мембрану. Очищенный Ват-8 фрагмент размером 7,5 тыс. оснований (1,0 мкг) смешивают с 0,5 мкг pBR 327 векторной ДНК, которую предварительно расщепляют эндонуклеазой Bam HI (2 едО так и 0,2 ед, щелочной Лосфатазы теленка в течение 1 ч при 37ffC, полученную смесь депротейвизируют и повторно суспендируют. Смешанные фрагменты обрабатывают Т4 лигазой (2 ед,), исполь35
40
55
Q
e Q 5 Q
5
0
5
зуют для трансформации Е, coli C600 ГЕСА клеток, отбирают колонии, устойчивые к ампициллину. Мини-препарат для получения плазмидной ДНК выделяют из двенадцати этих клонов, ДНК расщепляют с Bam HI для foro, чтобы продемонстрировать наличие pBR 327 вектора и Ёат-8 фрагментов размером
25 мкг pMON 90 ДНК расщепляют Bgl II (25 ед., 2 ч, 37°С) и Bgl II фрагмент размером 2,6 тыс. оснований очищают, используя NA-45 мембрану. Для создания тупых концов фрагмент (2 мкг) повторно суспендируют в Юмкл 50 мМ МаС1, 6,6 мМ Трис-HCl рН 8,
1 мМ и добавляют одну единицу большого (Ьрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 Е. coli. После инкубирования в течение 20 мин при 22°С, полимеразу Кленова инактивируют нагреванием и добавляют 10 ед. Hind III. Расщепление Hind III проводят в течение 1 ч при 37°С и затем фермент инактивируют нагреванием. Добавляют тупые фрагменты Hind III - Bgl II (1 мкг) к 0,25 мкг Hind III - Pvu II фрагменту размером 2,2 тыс, оснований pBR 322, который получают путем расщепления Hind III и Pvu II, и затем обработки щелочной фосфатазой теленка. После лигирования с использованием 100 ед, Т4 ДНК лига- зы, трансформации Е. coli ZE392 клеток и отбора устойчивых к ампициллину колоний, получают девятнадцать колоний. Плазмидные мини-препараты получают из двенадцати колоний и расщепляют Hind III для определения размера рекомбинантной плазмиды и Sma I для определения правильности включения фрагмента. Одну плазмиду с правильной структурой обозначают pMON113.
Пример 5. Двадцать мкг плаэ- миды pMON 109 расщепляют Eco RI и Bam HI (по 20 ед. каждой, 2ч, ) и Bam HI - Eco RI фрагмент размером 3,4 тыс. оснований очищают, используя NA-45 мембрану, 20 мкг плазмиды/ рМОМ 41 расщепляют Bam HI и Pvu I | (20 каждой, 2 ч, 37°С) и Ват HI - Pvu I фрагмент размером 1,5 тыс. осto
15
20
25
незнаний очищают, используя NA-45 мем1 брану.
20 мкг pMON 113 ДНК расщепляют Pvu I и Eco RI (по 2 ед„ каждой, 2 ч, 37°С) и Pvu I - Eco RI фрагмент размером 3,1 тыс. оснований очищают, используя NA-45 мембрану. Для сборки плазмиды рМОМ 120 Eco RI - Pvu I фрагмент размером 3,1 тыс, оснований рМОМ 113 (1,5 мкг) смешивают с 1,5 мкг фрагмента Eco RI - Bam HI размером 3,4 тыс. оснований из pMON 109. После обработки Т4 пигазой (3 ед.) в течение 16 ч при 10°С ли- газу инактивируют нагреванием (1рмин 70°С) и добавляют 5 еде Bam HI, Расщепление продолжают в течение 30 мин при 37 С и в это время Bam KI эндону- клеазу инактивируют нагреванием как и ранее. Затем-0,75 мкг Pvu I -Bam HI фрагмента размером 1,5 тыс, оснований из pMON 41 добавляют вместе с Т4 ДНК лигазой (2 ед.) и свежим АТР до конечной концентрации 0,75 мМ. Окончательное взаимодействие с лигазой проводят в течение 4 ч при и смесь используют для трансформации Е. coli ZE 392 клеток с последующим отбором клеток, устойчивых к спекти- номицину, как описано ранее, Плазмид- ные мини-препараты из двенадцати из нескольких тысяч колоний скриниругот для получения плазмид размером приблизительно 8 тыс, оснований, содер- дащих одиночные сайты Bam HI и Eco RI, Одну плазмиду, которая имела нужную структуру, обозначают pMON120, pMON 120 ДНК получают аналогично примеру 1.
Культуру Е. coli, содержащую pMON 120, депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39263,
Пример 6. Плазмида pMON 75 содержит химерический NOS-NPTII-NOS ген. Эту плазмиду и pMON 128 расщепляют Eco RI и очищают фрагмент размером 1,5 тыс, оснований, содержащий NOS-MPTII-NOS-ген.
. .50
Плазмиду рМОК 120 расщепляют Eco R1
и обрабатывают щелочной фосфатазой теленка. После фенольной депротеини- зации и осаждения этанолом Eco RI, отщепленную pMON 120, линейную ДНК смешивают с 0,5 мкг размером 1,5 тыс, оснований Eco RI химерическим генным фрагментом pMON 75 или 76. Получен- ную смесь обрабатывают 2 ед. Т4 ДНК
30
35
40
45
5
0
5
0
0
5
0
5
лигазы в течение 1 ч при 220С„ После трансформации Е. coli клеток и отбора колоний, устойчивых к спектиноми- цину (50 мкг/мл), выявляют несколько тысяч колоний. Шесть из них отбирают, выращивают и готовят плазмидные мини- препараты, Плазмидные ДНК расщепляют Eco RI для проверки на включение химерического гена размером 1,5 тыс. оснований и Bam HI для определения ориентации включения. Bam HI расщепление показало, что в плазмиде рМОМ 128 химерический ген транскрибируется1 Ј том же самом направлении, что и интактный нопалинсинтазный ген рМОМ 120. Культуру Е. coli, содержа--.- щую pMON 128, депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39264. Ориентация вставки в pMON 129 противоположна ориентации в pMON 128 появление дополнительного фрагмента Bam HI размером 1,5 тыс, оснований Bam HI при расщеплении плазмиды pMON 129, свидетельствует о том, что плазмида pKON 129 несет тандем дупликацией хи, мерического NOS-NPT II-NOS гена.
Пример 7. Плазмиду pMON 128 переносят в хлорамфениколустойчивый Agrobacterium tumefaciens штамм GV 3111-C58C1, несущий Ti плазмиду pTi B65 3 , используя методику скрещивания на пластине трех родителей, следующим образом. мл культуры Е. coli несущей pMON 128,, смешивают с 0,2 мл культуры Е, coli штамма НВ101, несущего pRK 2013 плазмиду и 0,2 мл GV 311 клеток. Полученную смесь клеток культивируют в бульоне Луриа (LB), помещенном на LB пластину, и инкубируют в течение 16-24 ч при 30 С, чтобы дать возможность осуществиться переносу плазмиды и образованию коинтегративных плазмид, Клет ки повторно суспендируют в 3 мл 10 мМ MgSO q. и затем 0,2 мл аликвотной части распределяют на LB пластине, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола и по 100 мкг/мл спектиномицин и стрептомицина. После инкубирования в течение 48 ч при 30 С получают приблизительно 10 колоний. Выбирают одну колонию и выращивают при Зр°С в LB среде. со держащей хлорамфеникол, спектиномицин и стрептомицин в указанных выше концентрациях,
Готовят отдельный тип коинтеграти- вной плазмиды для использования в
контрольном эксперименте путем включения pMON 120 в клетки A, tumefaciens и отбора клеток с коинтегративными плазмидами, используя спектиномицин и стрептомицин. Аналогично pMON 120 эти плазмиды не содержат химерический NOS-NPT-II-NOS ген.
Пример 8. Растворы, которые
используют при культивировании растительных клеток,
Заявители использовали следующие
астворы в расчете на 1л.
Смесь ферментов15
Целлюлизин5 г
Макерозим0,7 г
Ампициллин0,4
КН2Р0427,2 мг
КМ0310120
СаС12
MgS( 7 Н2 О KI
CuS04- 5 Н20 Маннитол MS9 MS соли Сахароза Витамины В5 Маннитол
Фитогормоны Бензиладенин (РА) 2,4-Д
S - ES MS соли Сахароза Витамины В5
1,48 г 246 мг 0,16 мг 0,025 for 110 г25
4,3
30,0 г 1 мл 90,0 г
30
0,5 мг 1 мг 4,3 г 30 г 1 мл
35
Маннитол 30 г
Карбенициллин10 мг
Фитогормоны Индолуксусная
кислота0,1 мг
SO MS соли4,3 г
Сахароза30,0 г
Витамины В51 мл Питательная среда пластин
MS соли.4,3 г
Сахароза30,0 г
Витамины В51 мл
Маннитол30,0 г
Фитогормоны
ВА0,5 мг
S 2C MS соли4,3 г
Сахароза30 г
Витамины В51 мл
Фитогормоны Хлорфеноксиуксусная
кислота2 мг
S 104 MS соли4,3 г
Сахароза30,0 г
Витамины В51 мл
s
10
15
20
25
30
35
40
45
50
5
Фитогормоны
ВА0,1 мг
NAA1 мг
MS 11 MS соли4,3 г
Сахароза30,0 г
Витамины В51 мл
Фитогормоны Зеатин1 мг
Источники витамина В5 Миоинозитол100 г
Тиамин НС110 г
Никотиновая
кислота1 г
-, Пиродоксин НС11 г
Промывочный состав MS соли0,43 г
Сахароза 171,2 г
PVP - 4040,0 г
MS соли поступают в виде предварительной смеси в виде сухого порошка.
Пример 9, Растения петуньи Митчелла выращивают в камерах роста с двумя или тремя группами флуоресцентных ламп и двумя группами ламп накаливания (около 5000 лк). Темпе- ратуру поддерживают постоянной при 21°С и освещают растения в течение 12 ч в день. Растения выращивают в смеси 50/50 вермикулита и РМ о смеси Растения поливают раз в день питательным раствором Хогланда. Ткани берут с темно-зеленых растений с компактным кустистым ростом. Листья стерилизуют в растворе 10%-ной коммерческой хлорной извести и небольшого количества детергента Tween 20 в течение 20 мин с периодическим помешиванием. Листья смачивают; два или три раза в дистиллированной воде. Из листьев вырезают тонкие полоски (около 1 мм) перпендикулярно основной жилке„ Полоски помещают в смесь ферментов, взятых в отношении около 1 г ткани на 10 мл ферментов. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют в темнот или в слабом рассеянном свете при этом непрерывно осторожно перемешивают (около 40 об/мин) на роторном шейкере. Инкубирование с ферментами обычно проводят в течение ночи, т.е. около 16-20 ч.
Расщепленную смесь сеют через сита 68, 74 и 88 меш для удаления крупных осколков и лиственного материала. Фильтрат центрифугируют при 70 - 100 g в течение 5 мин до образования конгломератов протопластов. Надосадоч-
ную жидкость декантируют и хлопья осторожно повторно суспендируют в промы вочном растворе, Эту суспензию выпивают в склянки Бэбкока. Склянки за- полняют на 2-3 см над основанием горлышка. 1 мл растительной среды MS9 осторожно помещают слоем поверх промывочного раствора.
Склянки Бэбкока сбалансируют и цен трифугируют при 500-1000 об/мин в течение 10-2D мин. Протопласты образуют компактную полоску в горлышке у поверхности раздела. Эту полоску извлекают пипеткой, приняв предосторожно- сти, чтобы не прихватить излишек раствора. Протопласты разбавляют MS9. В этот момент протопласты промывают MS9 или разбавляют для культивирования без промывки.
Протопласты суспендируют в MS9 среде до 5 х 10 на мл и помещают в Т-75 колбы по 6 мл в колбу. Колбу инкубируют на уровне поверхности при слабом рассеянном свете или в темно- те при 26-28°С, На третий день после удаления ферментов из тканей листа в каждую колбу добавляют MSO (среду, которая не содержала маннитола), используя количество, равное половине Исходного объема. То же количество среды MSO добавляют снова на 4 день. Это снижает концентрацию маннитола до около 0,33 М после первого разбавления и до около 0,25 М после второ- го разбавления.
Пример 10. На пятый день После выделения протопласта, пяти-се- мидневные табачные суспензионные Культуры табака (TXD клетки) разбав- ляют при необходимости MS2C средой до точки, когда 1 мл легко распределяется по поверхности агарной среды В 100 х 15 мм чашках Петри, т.е. до 10-15% суспензии (вес/объем)„ Агар- ную среду получают, смешивая 0,8%- ный агар со средой MS-ES, обрабатывая смесь в автоклаве и охлаждая до тех пор, пока она не отвердилась в чашках. Один мл TXD суспензии распределяют на питательной среде (25 мл), 8,5 см диск ватманской фильтровальной бумаги кладут на ТХД клетки и разглаживают. 7 см диска той же бумаги кладут в центр большего диска.
Отдельно аликвотные части культуры клеток A, tumefaciens клеток добавляют в склянки, которые содержат растительные клетки. Один набор аликвотных
g 0
5 0 ,
д
0
5
часуей содержит клетки с pMON 128 : Ti коинтегративными. плазмидами, содер, жащими химерические NOS-NPT II-MOS г е- гены. Другой набор аликвотных частей содержит клетки с pMON 120: Ti к оин- тегративными-плаэмидами, которые не содержат химерический NOS-APT II-NOS ген.
Бактерии добавляют в склянки при плотности 10 клеток/мл. 0,5 мл смеси клеток распределяют в тонком слое на поверхности 7 см диска фильтроваль ной бумаги. Затем пластины герметизируют паропленкой или в пластиковых пакетах и инкубируют при прямом флуоресцентном освещении не более чем по 5 пластин в стопке.
Через 7 дней колонии стали различимы. Через 14 дней 7 см диски с прилипшими к ним колониями переносят на новую MSO агарозную среду (без питающих клеток), содержащую 500 мкг/мл карбенициллина, а также 50 мкг/мл ка- намицинсульфата. Через две недели наблюдают интенсивно растущие зеленые колонии на пластинах, которые содержат растительные клетки, совместно культивированные с A. tumefaciens штаммами, содержащими коинтегратив- ную NOS-NPT II гшазмиду pMON 128. На пластинах не наблюдают трансформиро-1 ванные колонии, которые содержат растительные клетки, совместно культивированные с A, tumefaciens штаммами, содержащими коинтегративную плазмиду pMON 120. Канамицинустойчивые трансформанты сохраняют рост в культураль ной среде, содержащей канамицин. Экс перименты Саузерна подтверждают, что эти .клетки содержат химерический NOS- NPT II ген.
Оба набора трансформированных клеток (и третий набор клеток, которые были трансформированы таким же способом химерическим геном, кодирующим фермент NPT типа 1), исследуют на устойчивость к канамицину.
Пример 11, Трансформированные канамицинустойчивые колонии содержат как опухолевые, так и неопухолевые клетки. Отделяют неопухолевые трансформированные клетки от опухолевых трансформированных клеток и осуществляют регенерацию дифференцированных растительных тканей из неопухолевых клеток,
I;
Колонии выращивают на MS 104 ага- розной среде, содержащей 30 мкг/мл
канамицинсульфата и 500 мкг/мл карбе- нициллина, до тех пор, пока они не достигают около 1 см в диаметре, Опухолевые колонии, которые имеют несколько более бледный оттенок зеленого и являются более рыхлыми нежели неопухолевые колонии, удаляют из MS 104 среды и помещают на MS 11 среду, содержащую 30 мкг/мл канамицина и 500 мкг/мл карбенициллина. По мере роста колоний те из них, которые были бледно-зелеными и имели рыхлую структуру, удаляют и выбрасывают.
MS11 среда, содержит зеатин, фито- гормон, который вызывает спонтанное образование ростков в неопухолевых кот лониях, Обнаруживают несколько рост10
15
Формула изобретения
Способ получения трансформированных клеток двудольных растений путем совместного культивирования раститель ной клетки и бактерий Agrobacterium tumefaciens, о. тличающийся тем, что, с целью ПОВЫШЕНИЯ выхода нормальных трансформированных растительных клеток, конструируют плазмиду pMON 128 путем включения в вектор рМОН 120 гена устойчивости к антибиотикам, вносят полученную плазмиду в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens GV 3111-C58 Cl/pTi B65 3 tra конъюгацией трех штаммов бактерий Escherichia coli/pMON 128, Escheric- hia coli HB 101 pRK 2013 и AgrobacteKOB, развивающихся из канамицинустой- 20 tumefaciens CV 3111, отбирают чивых колоний. Эти ростки выращиваютштамм бактерий A. tumefaciens с KdHHдо нужного размера и срезают острымтегративной плазмидой pMON 128:pTi
лезвием, а затем вводят в агарознуюВ65 3 trac на селективной среде, сосреду без фитогормонов, например MSO, . держащей 25 мкг/мл хлорамфеникола и где они могли развить корни. При же- . 25 по 1р° мкг/мл спектиномицина и стреплании среду дополняют нафталинуксус- ной кислотой для того, чтобы вызвать образование корней. Растения выращивают до нужного размера в агарозной среде, а затем переносят в почву. При правильном уходе растения растут до зрелости и дают семена.
Формула изобретения
Способ получения трансформированных клеток двудольных растений путем совместного культивирования раститель ной клетки и бактерий Agrobacterium tumefaciens, о. тличающийся тем, что, с целью ПОВЫШЕНИЯ выхода нормальных трансформированных растительных клеток, конструируют плазмиду pMON 128 путем включения в вектор рМОН 120 гена устойчивости к антибиотикам, вносят полученную плазмиду в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens GV 3111-C58 Cl/pTi B65 3 tra конъюгацией трех штаммов бактерий Escherichia coli/pMON 128, Escheric- hia coli HB 101 pRK 2013 и Agrobacteтомидина, ген устойчивости к антибиотикам вводят в растительные клетки в результате совместного культивирования протопластов с бактериями A. tumefaciens, содержащими коинтегратив- ную плазмиду, и отбирают трансформированные растительные клетки на селек тивной среде, содержащей соответствующий антибиотик.
